A型口蹄疫病毒多肽抗原表位的原核表達及多克隆抗體的制備

程凱慧　沈付嬈　鄒積振　苗自利　解曉莉　張亮　楊宏軍　何洪彬

摘要：為構(gòu)建A型口蹄疫病毒多肽抗原表位的原核表達載體，并制備多克隆抗體，利用基因合成技術(shù)將不同株的A型口蹄疫病毒抗原表位A-A10-61-VP1（第141～160位氨基酸）、A-A10-61-VP1（第200～212位氨基酸）、A22Iraq-VP1（第 136～164位氨基酸）串聯(lián)，在其間引入合適的linker序列，重組得到pET-28a（+）質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)表達重組蛋白，免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。成功構(gòu)建了A型口蹄疫病毒抗原表位原核表達載體，獲得高純度重組蛋白和含A型口蹄疫病毒抗體的兔抗血清，為A型口蹄疫病毒診斷試劑盒的研發(fā)和A型口蹄疫病毒表位多肽疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：A型口蹄疫病毒;抗原表位;重組蛋白;多肽疫苗

中圖分類號：S852.65 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0184-03

口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起一種急性、高度接觸性傳染病，除可以感染家畜外，還可以感染多種野生動物，包括象[1]、大額牛[2-3]、牦牛[4]、水鹿、梅花鹿和野生水牛[5]等。本病以流行范圍廣、傳播速度快和發(fā)病率高為特點，一旦暴發(fā)會給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，被國際獸醫(yī)局列為第一類烈性傳染病。作為一種全球范圍內(nèi)的重大動物疫病，已成為當(dāng)前動物及其產(chǎn)品國際貿(mào)易的主要障礙。

FMDV屬于小RNA病毒科，極易變異，根據(jù)交叉保護試驗已確定的病毒血清型有7個：O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型。在亞洲地區(qū)，主要流行A、O和Asia1型，近幾年尤其A型較多。其基因組編碼4個結(jié)構(gòu)蛋白和8個非結(jié)構(gòu)蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白包括VP1、VP2、VP3和VP4。其中，VP1、VP2和VP3位于病毒表面，VP4位于病毒內(nèi)部。VP1上有B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，因此VP1蛋白的抗原表位常被作為診斷抗原，用于FMDV相應(yīng)亞型抗體水平的檢測和表位疫苗的研制。

FMDV抗原結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，不同血清型、基因型和分離株間抗原位點和抗原表位都有所差別，不同的株系有不同的研究成果，如A5亞型有2個抗原位點能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，一個位于VP1的羧基末端，另一個位于VP2的B-C環(huán)上[6]。FMDV A10包括4個抗原位點，分別位于VP1的G-H環(huán)、VP1的169位、VP1的羧基端、VP3上的部分殘基[7]。有試驗驗證發(fā)現(xiàn)位于VP1第21～40位氨基酸和161-羧基端的2個表位能夠增強FMD合成肽疫苗的免疫原性[8]。VP1的第135～144位氨基酸和第150～160位氨基酸也已被證實能夠在牛的免疫作用中起輔助作用[9]。VP1的140～160位合成肽能夠顯著刺激牛外周血單核細(xì)胞增殖[10]。

綜上所述，本試驗利用原核表達系統(tǒng)將串聯(lián)的A型口蹄疫VP1多肽抗原表位進行了表達，獲得A型口蹄疫病毒多肽抗原表位，一方面可以建立A型口蹄疫病毒的檢測方法，為臨床樣本的檢測提供方便;另一方面可以建立抗原表位多肽疫苗的技術(shù)平臺，為A型口蹄疫肽苗的研制打下堅實的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株與試劑

原核表達載體PET-28a由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心實驗室保存，DH5α感受態(tài)細(xì)胞、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、NotⅠ/EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒提取試劑盒等，均購自寶生物工程（大連）有限公司;過硫酸銨、TEMED、硝酸纖維素膜、透析袋等，均為國產(chǎn)或進口分析純;溶菌酶、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HRP標(biāo)記兔抗牛IgG，購自Sigma公司;2～3 kg/只的新西蘭白兔，購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種兔試驗基地。

1.2A型FMDV多肽抗原表位原核表達載體的構(gòu)建

根據(jù)我國及周邊國家FMDV流行株的抗原表位基因，確定多肽抗原表位基因，同時考慮密碼子偏嗜性，利用化學(xué)合成的方法將A型FMDV流行株的抗原表位基因利用柔性氨基酸串聯(lián)，兩端并設(shè)計有NotⅠ/EcoRⅠ酶切位點。全基因共969 bp，將目的片段連接到PET-28a上，雙酶切鑒定，并送北京六合華大基因生物技術(shù)有限公司測序鑒定。

1.3串聯(lián)抗原表位的誘導(dǎo)表達

重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確后，轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，搖菌，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)到D600 nm為0.8左右時，分別加入IPTG，終濃度分別為0.1～2.0 mmol/L，誘導(dǎo)時間分別從3～7 h不同時間點收集菌液，離心收集菌體，加入1%的SDS和蛋白上樣緩沖液（4 ∶1比例），煮沸5 min處理樣品，12 000 r/min離心1 min，取上清10 μL，沉淀加入1%的SDS和蛋白上樣緩沖液（4 ∶1比例）處理，上清和沉淀同時進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍染色，并脫色鑒定。

1.4表達蛋白的純化

按照最佳誘導(dǎo)表達條件大量誘導(dǎo)目的蛋白，收集誘導(dǎo)表達的菌體，按照每10 mL菌液收集的菌體加入630 μL裂解緩沖液、70 μL溶菌酶、10 μL PMSF（100 mmol/L）、1 μL胃蛋白酶抑制劑、1 μL胰蛋白酶抑制劑，重懸菌體，超聲破碎細(xì)胞，當(dāng)菌液變?yōu)榘胪该鲿r13 000 r/min離心30 min收集上清，依照 Ni-NTA 純化試劑盒說明書純化蛋白，并進行蛋白的復(fù)性。

1.5表達蛋白的western-blot分析

取純化的蛋白10 μL進行12% SDS-PAGE電泳，將SDS-PAGE凝膠上的目的條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂奶粉封閉，以His單抗作為一抗，HRP-山羊抗鼠IgG作為二抗，ECL顯色觀察。

1.6間接ELISA方法的建立

純化的蛋白作為抗原按不同的濃度包被96孔板酶標(biāo)板，用牛A型FMDV陽性血清做一抗，按照1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128的比例稀釋，與蛋白稀釋度形成矩陣，HPR-兔抗牛IgG 1 ∶5 000稀釋作為二抗，摸索蛋白和一抗的最佳濃度，初步建立A型FMDV間接ELISA檢測方法。

1.7多克隆抗體的制備及鑒定

根據(jù)參考文獻中的方法，試驗組免疫新西蘭大白兔2只，并以PET-28a作為空白對照組，免疫前采血，一免用完全弗式佐劑與蛋白1 ∶1的比例乳化，二免三免用不完全弗式佐劑與蛋白1 ∶1的比例乳化，對兔進行皮下多點免疫注射，每次免疫蛋白總量保證200 μg，免疫3次，每次免疫間隔期為2周，每次免疫前采血留樣，三免后14 d心臟采血，分離血清。采用建立的間接ELISA方法進行多克隆抗體效價的檢測，并進行Western-Blot驗證。

2結(jié)果與分析

2.1原核表達載體的雙酶切及測序鑒定

將構(gòu)建成功的原核表達載體用NotⅠ/EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切，經(jīng)電泳鑒定得到PET-28a（5 369 bp）和目的條帶（969 bp），和預(yù)期結(jié)果大小保持一致（圖1），測序結(jié)果顯示目的條帶與化學(xué)合成的多肽抗原表位基因序列保持一致，說明多肽抗原表位的原核表達載體構(gòu)建成功。

2.2蛋白的純化

按照探索規(guī)范的條件對目的蛋白進行大量誘導(dǎo)純化，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，發(fā)現(xiàn)成功誘導(dǎo)純化出與預(yù)期大小一致的目的蛋白條帶（圖2），約29.43 ku。

2.3Western-Blot分析

將純化的蛋白進行Western-Blot驗證分析，結(jié)果顯示有單一目的條帶出現(xiàn)（圖3），與預(yù)期結(jié)果一致，進一步驗證純化的蛋白是所需目的條帶。

2.4間接ELISA方法的建立

用矩陣的方法測得結(jié)果見表1，蛋白包被最佳濃度為 2.30 μg/mL，血清稀釋濃度為1 ∶20時，檢測效果最佳，其 P/N 為13.85。ELISA方法建立中P/N值越高，證明陽性值和陰性值差異越明顯，檢測方法越靈敏。成功建立FMDV-A型間接ELISA檢測方法。

2.5多克隆抗體抗體水平的檢測

FMDV-A型VP1蛋白抗原表位多肽融合蛋白與抗FMDV-A兔血清Western-Blot鑒定結(jié)果見圖4，有單一的目的條帶，結(jié)果說明FMDV-A型VP1蛋白抗原表位多肽融合蛋白免疫兔只能產(chǎn)生抗該抗原表位的抗體。

3討論

抗原表位是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ)，是抗原分子中誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。嚴(yán)格來說，抗體的特異性是針對表位而不是針對完整的抗原分子，這些抗原表位重組蛋白理論上與A型相對應(yīng)，但處于不同進化譜系的FMDV流行株刺激機體所產(chǎn)生的不同中和抗體之間，均可發(fā)生中和反應(yīng)，為拓展宿主防御系統(tǒng)對病毒表位的識別提供可能。有研究表明，根據(jù)對FMDV主要抗原表位的研究結(jié)果，出現(xiàn)了許多的多肽疫苗。其中，Brown等將第141～148位氨基酸和第200～213位氨基酸用鏈接肽連接起來，通過原核表達系統(tǒng)獲得了表達，免疫豬、牛等動物都取得了良好的免疫效果[11];Dimarch等同樣選用VP1上的第141～148位氨基酸和第200～213位氨基酸，用1個絲氨酸和2個脯氨酸組成的鏈接肽使多肽具有空間立體結(jié)構(gòu)，使免疫脈鼠后的抗體水平得到極大的提高[8];VP1基因的第140～160、200～213位氨基酸肽段是決定FMDV免疫原性的主要B細(xì)胞抗原表位， 串聯(lián)

起來可以增強抗原的免疫原性[12]。本研究對FMDV-A型流行株VP1蛋白上的該2個抗原表位進行多次重復(fù)串聯(lián)，同時注意各抗原表位的長度不宜太長，防止形成空間結(jié)構(gòu)或者存在疏水基，這樣不利于后期蛋白的純化，過少的抗原表位抗原位點偏少，不能很好地與抗體結(jié)合，不能產(chǎn)生足夠的中和抗體。同時，各抗原表位之間利用柔性氨基酸進行連接，使各抗原表位之間不形成空間結(jié)構(gòu)，保證各抗原表位的線性結(jié)構(gòu)或獨立的空間構(gòu)象，保持其獨立的生物學(xué)特性。最終選取了由不同毒株FMDV-A型VP1蛋白上的3個抗原表位進行串聯(lián)組成多表位抗原，同時進行了3次重復(fù)。另外，根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏愛性，對A型串聯(lián)抗原表位基因上的部分密碼子進行了同義突變，這樣可提高串聯(lián)抗原表位基因在大腸桿菌中的表達效率。

因此，針對FMDV-A型VP1基因的抗原表位進行研究，不但對口蹄疫基因遺傳變異有指導(dǎo)作用，而且對口蹄疫病毒的毒株型和亞型的分析、流行病毒調(diào)查及疫源地追蹤，甚至對研制最新型的口蹄疫疫苗具有很好的支撐。

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