銨硝混合營(yíng)養(yǎng)對(duì)煙草苗期氮代謝酶及內(nèi)源生長(zhǎng)素的影響

宋文靜　宋科　董建新　李永亮　況帥　禚其翠　李帥　梁洪波

摘要：為探究不同硝響應(yīng)型煙草品種氮素代謝關(guān)鍵酶活性對(duì)不同銨硝配比的響應(yīng)，以硝響應(yīng)度強(qiáng)的煙草品種NC89和硝響應(yīng)度弱的煙草品種中煙100為供試材料，在控制條件下進(jìn)行水培處理，研究3種銨硝配比對(duì)2個(gè)品種煙株生物量積累和氮素吸收的影響，以及氮素同化過(guò)程中相關(guān)酶活性和內(nèi)源生長(zhǎng)素含量對(duì)不同硝銨配比的響應(yīng)。結(jié)果表明，銨硝比50/50處理可顯著促進(jìn)不同硝響應(yīng)型煙草品種生物量的增加和氮素積累;硝響應(yīng)度強(qiáng)煙草品種NC89低硝處理地上部硝酸還原酶（NR）活性顯著高于銨硝比50/50處理，而根系中的差異則相反，硝響應(yīng)度弱煙草品種中煙100不同處理下NR活性無(wú)顯著差異;中煙100和NC89煙株體內(nèi)谷氨酰胺合成酶（GS）活性整體隨銨態(tài)氮比例的增加而提高;中煙100和NC89根系中谷氨酸脫氫酶（GDH）活性均以全硝處理最低，中煙100較NC89具有更高的GDH活性來(lái)緩解高濃度NH4+;中煙100和NC89地上部和根系的生長(zhǎng)素含量均表現(xiàn)為最佳銨硝比50/50處理>全硝處理>低硝處理，中煙100全硝處理和低硝處理根系生長(zhǎng)素含量較銨硝比50/50處理的降幅與地上部基本一致，而硝響應(yīng)度強(qiáng)煙草品種NC89全硝處理和低硝處理根系中生長(zhǎng)素含量較銨硝比50/50處理的降幅遠(yuǎn)大于其地上部。由此推論，不同銨硝營(yíng)養(yǎng)下，不同硝響應(yīng)型煙草品種氮代謝酶及內(nèi)源生長(zhǎng)素存在響應(yīng)差異。

關(guān)鍵詞：銨硝配比;煙草;氮代謝酶活性;內(nèi)源生長(zhǎng)素

中圖分類號(hào)： S572.06文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）08-0100-05

如何提高煙葉品質(zhì)是烤煙生產(chǎn)上的關(guān)鍵問(wèn)題，煙葉的煙堿含量和吸食生理強(qiáng)度與煙葉中的氮素含量有關(guān)，而煙葉中的氮素含量不僅受土壤中氮素供應(yīng)量的影響，且取決于煙株對(duì)氮素的吸收利用效率。烤煙是喜硝作物，但適當(dāng)增銨卻能促進(jìn)烤煙的干物質(zhì)積累和根系發(fā)生與伸長(zhǎng)，這可能與不同銨硝營(yíng)養(yǎng)引起植株體內(nèi)氮代謝相關(guān)酶活性發(fā)生變化有關(guān)。硝酸還原酶（NR）是NO3-進(jìn)行同化過(guò)程的關(guān)鍵酶。谷氨酰胺合成酶（GS）是將無(wú)機(jī)態(tài)氮催化合成為有機(jī)態(tài)氮的關(guān)鍵酶[1-2]，根系直接吸收NO3-在NR的作用下還原成NO2-，NO2-在質(zhì)體中被亞硝酸還原酶（NiR）還原成NH3，形成的NH3在GS的作用下形成氨基酸，該過(guò)程需要消耗大量糖類來(lái)提供碳架。李彩鳳等研究發(fā)現(xiàn)，不同氮素形態(tài)處理的甜菜體內(nèi)氮同化相關(guān)酶活性不同，其中硝酸還原酶活性隨硝態(tài)氮比例的增大而升高[2]，郝敬虹等[3]也得到相似的試驗(yàn)結(jié)果。Song等研究發(fā)現(xiàn)，與單一NO3-營(yíng)養(yǎng)相比，在銨營(yíng)養(yǎng)增加時(shí)，水稻苗期根系NR活性提高[4-5]，而銨硝營(yíng)養(yǎng)處理對(duì)水稻苗期地上部NR活性的影響與根系一致[6-7]。Magalhes等研究指出，單一銨態(tài)氮源處理時(shí)，玉米植株中的GS活性隨著NH4+濃度的升高而增大，且地上部高于地下部[8]。張宏紀(jì)等研究表明，在同一施氮水平下，GS活性隨銨硝比例的增大而增大[9]。劉衛(wèi)群等研究發(fā)現(xiàn)，單純對(duì)烤煙施銨態(tài)氮的處理，煙株體內(nèi)NR、GS活性較高[10]。谷氨酸脫氫酶（GDH）作為參與植物同化氮素的主要酶之一，在植物氮代謝中起著重要作用?，F(xiàn)有研究推測(cè)，GDH可能能夠有效緩解植物的銨毒害作用[11]。在不同植物中，GDH對(duì)外界NH4+有不同的反應(yīng)濃度，因此不同植物能夠適應(yīng)的NH4+濃度不同，這可能與GDH自身結(jié)構(gòu)上的差異以及在不同植物體中產(chǎn)生的同工酶有關(guān)[12]。

生長(zhǎng)素（IAA）是植物體最重要的內(nèi)源激素，對(duì)植物根系的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。王波等對(duì)生菜的研究發(fā)現(xiàn)，銨硝混合營(yíng)養(yǎng)處理比單一硝營(yíng)養(yǎng)處理的IAA含量高[13]。郭紅祥等通過(guò)水培試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同氮素形態(tài)處理的煙苗IAA含量達(dá)到顯著差異水平[14]。說(shuō)明植物內(nèi)源生長(zhǎng)素含量對(duì)不同銨硝營(yíng)養(yǎng)的響應(yīng)不同。

目前關(guān)于不同硝響應(yīng)型煙草品種氮代謝關(guān)鍵酶對(duì)不同銨硝配比的響應(yīng)差異研究較少，因此本試驗(yàn)采用水培方法，研究中煙100和NC89在不同銨硝配比下氮代謝關(guān)鍵酶活性和內(nèi)源生長(zhǎng)素含量的差異，以期通過(guò)氮代謝途徑關(guān)鍵酶活性探明烤煙對(duì)不同銨硝配比的響應(yīng)機(jī)制。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2016年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所試驗(yàn)場(chǎng)溫室進(jìn)行。

1.2供試材料

NC89是美國(guó)1976年雜交育成的品種，中煙100是中國(guó)煙草遺傳育種研究（北方）中心選育的優(yōu)質(zhì)多抗烤煙新品種，均是國(guó)內(nèi)主栽品種。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將消毒后的NC89和中煙100裸種分別播種于塑料培養(yǎng)盒中，待幼苗出土25 d后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗，用清水洗凈根部基質(zhì)，用海綿包裹煙苗根莖結(jié)合處并固定在Karat board（KT板）上，轉(zhuǎn)移至裝有15 L清水的塑料圓盆式周轉(zhuǎn)箱中培養(yǎng)3 d，每個(gè)圓盆式周轉(zhuǎn)箱（pot）培養(yǎng)3株煙苗，緩苗后再用不含氮素的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)2 d，然后進(jìn)行不同銨硝配比處理。改良后的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液成分為：N 3.75 mmol/L、P 0.25 mmol/L、K 2.00 mmol/L、Mg 0.25 mmol/L、Ca 3.75 mmol/L、Fe（Fe-EDTA）20.00 μmol/L、Mn 9.00 μmol/L、B 46.00 μmol/L、Zn 0.80 μmol/L、Cu 0.30 μmol/L、Mo 0.50 μmol/L。

對(duì)NC89和中煙100設(shè)置3個(gè)銨硝配比處理，分別為NO3--N 3.75 mmol/L（NH4+/NO3-=0/100，全硝處理）;NH4+-N和NO3--N各1.875 mmol/L（NH4+/NO3-=50/50，最佳銨硝比處理）;NH4+-N 3.65 mmol/L，NO3--N 0.10 mmol/L（NH4+/NO3-=97/3，低硝處理）。其中N以NaNO3、KNO3、（NH4）2SO4和NH4NO3的形式加入。營(yíng)養(yǎng)液每2 d更換1次，并用0.1 mol/L的HCl將pH值調(diào)至6.0。自煙苗處理當(dāng)天起，第7天取樣進(jìn)行測(cè)定。

1.4測(cè)定內(nèi)容與方法

1.4.1生物量和氮含量測(cè)定

將煙株樣品分部位置于80 ℃烘箱48 h，然后用千分之一天平分別稱其質(zhì)量并記錄?？偟繀⒄誝C/T 33—1996《煙草及煙草制品 總氮的測(cè)定 克達(dá)爾法》，采用全自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2氮代謝酶含量測(cè)定

NR活性參照李合生的方法[15]測(cè)定。GS活性參照段英華等的方法[16]測(cè)定。GDH活性參照Groat等的方法[17]測(cè)定。

1.4.3生長(zhǎng)素濃度測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定IAA濃度。

1.5數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，采用SAS 9.3數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1銨硝混合營(yíng)養(yǎng)對(duì)煙草苗期生物量的影響

由表1可知，處理后第7天，最佳銨硝比處理中煙100和NC89的地上部和根系干質(zhì)量均顯著大于低硝處理，硝響應(yīng)度弱煙草品種中煙100全硝處理與低硝處理無(wú)顯著差異，而NC89 3個(gè)處理間均達(dá)到顯著差異水平。說(shuō)明與全硝、低硝營(yíng)養(yǎng)條件相比，最佳銨硝比更能促進(jìn)煙苗地上部和根系干物質(zhì)的積累。另外，與硝響應(yīng)度弱煙草品種中煙100相比，硝響應(yīng)度強(qiáng)煙草品種NC89處理間差異更大，說(shuō)明NC89對(duì)銨硝營(yíng)養(yǎng)更加敏感。

2.2銨硝混合營(yíng)養(yǎng)對(duì)煙草苗期氮積累量的影響

由圖1可知，處理第7天，不同處理中煙100、NC89的氮積累量存在差異，2個(gè)品種最佳銨硝比處理的氮含量均顯著高于其他處理。不同硝響應(yīng)度煙草品種氮素積累量趨勢(shì)一致，均為最佳銨硝比處理顯著大于全硝、低硝處理，且全硝處理和低硝處理無(wú)顯著差異。說(shuō)明最佳銨硝比營(yíng)養(yǎng)條件能夠有效促進(jìn)煙苗對(duì)氮素的吸收利用。

2.3銨硝混合營(yíng)養(yǎng)對(duì)煙草苗期NR活性的影響

從圖2可以看出，在不同銨硝配比下，硝響應(yīng)度弱煙草品種中煙100地上部和根系NR活性無(wú)顯著差異，說(shuō)明在不同銨硝營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中，中煙100始終保持較為穩(wěn)定的硝同化能力。硝[CM（25]響應(yīng)度強(qiáng)煙草品種NC89地上部與根系NR活性變化趨勢(shì)不一致，由于大部分NO3-在根系中被還原，因此根系中的NR活性更能代表幼苗的硝態(tài)氮同化能力，與低硝處理相比，全硝處理和銨硝比50/50處理可促進(jìn)根系NR活性的提高，其中銨硝比50/50處理的促進(jìn)效果達(dá)到顯著水平，這與Alexander等的研究結(jié)果[5]一致。

2.4銨硝混合營(yíng)養(yǎng)對(duì)煙草苗期GS活性的影響

由圖3可知，中煙100和NC89的GS活性整體隨著NH4+濃度的升高而增大，這與劉衛(wèi)群等的研究結(jié)果[10]一致;且2個(gè)品種全硝處理與低硝處理地上部和根系中的GS活性差異均達(dá)到顯著水平。與硝響應(yīng)度弱煙草品種中煙100相比，硝響應(yīng)度強(qiáng)煙草品種NC89處理間差異更大，3個(gè)處理間地上部和根系中的GS活性均達(dá)到顯著差異水平。說(shuō)明在不同銨硝配比條件下，不同煙草品種的GS活性產(chǎn)生的響應(yīng)程度不同。

2.5銨硝混合營(yíng)養(yǎng)對(duì)煙草苗期GDH活性的影響

根據(jù)吳頌如等的研究[12]，不同植物能夠適應(yīng)的NH4+濃度不同，這可能與GDH自身結(jié)構(gòu)上的差異以及在不同植物體中產(chǎn)生的同工酶有關(guān)。筆者所在實(shí)驗(yàn)室在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，烤煙品種NC89對(duì)不同銨硝配比有不同的響應(yīng)[18]，因此猜測(cè)，不同硝響應(yīng)型煙草品種的GDH活性對(duì)相同NH4+濃度有不同的響應(yīng)。由圖4可知，不同硝響應(yīng)度煙草品種地上部GDH活性均無(wú)顯著差異，根系中的GDH活性均以全硝處理最低，這可能是由于大部分NH4+在根系中累積，引起根系中的GDH活性變化。在全硝處理、銨硝比50/50處理和低硝處理下，硝響應(yīng)度弱煙草品種中煙100根系GDH活性分別比NC89高171.4%、91.3%和42.9%，因此中煙100具有更高的GDH活性來(lái)緩解高濃度NH4+脅迫。

2.6銨硝混合營(yíng)養(yǎng)對(duì)煙草苗期內(nèi)源生長(zhǎng)素的影響

從圖5可看出，不同硝響應(yīng)度煙草品種地上部和根系生長(zhǎng)素含量均表現(xiàn)為銨硝比50/50處理>全硝處理>低硝處理。與銨硝比50/50處理相比，中煙100全硝處理地上部和根系生長(zhǎng)素含量分別降低13.3%和12.0%，中煙100低硝處理地上部和根系生長(zhǎng)素含量分別降低27.1%和32.8%。與NC89銨硝比50/50處理相比，NC89全硝處理在地上部和根系生長(zhǎng)素含量分別降低9.1%和40.0%，NC89低硝處理在地上部和根系生長(zhǎng)素含量分別降低21.0%和 62.5%。與銨硝比50/50處理相比，全硝、低硝處理的煙草品種中煙100地上部與根系中生長(zhǎng)素含量的降幅基本相當(dāng)，而硝響應(yīng)度強(qiáng)煙草品種NC89根系中生長(zhǎng)素含量的降幅遠(yuǎn)大于其地上部，說(shuō)明NC89全硝、低硝處理均影響其生長(zhǎng)素由地上部向根系運(yùn)輸。

3結(jié)論與討論

饒學(xué)明研究認(rèn)為，銨硝比為50/50時(shí)烤煙根系干物質(zhì)積累量顯著增加[19]。本研究結(jié)果顯示，不同硝響應(yīng)度煙草品種全硝、低硝處理地上部和根系氮積累量均顯著低于銨硝比50/50處理，說(shuō)明銨硝比50/50處理可顯著促進(jìn)氮素的積累。NR是植物體內(nèi)一種重要的氮代謝酶，外源供應(yīng)氮素形態(tài)影響其活性，并且作物種類不同其變化趨勢(shì)也不同。由于大部分NO3-在根系中被還原，因此根系中的NR活性更能代表硝態(tài)氮的同化能力。本研究表明，硝響應(yīng)度強(qiáng)煙草品種NC89地上部與根系NR活性隨銨硝比的變化趨勢(shì)不一致，其中銨硝比50/50處理根系中NR活性顯著高于低硝處理;不同處理間硝響應(yīng)度弱煙草品種中煙100地上部和根系的NR活性沒(méi)有呈現(xiàn)出顯著差異。因此不同硝濃度條件下，硝響應(yīng)度強(qiáng)煙草品種NC89根系中的NR活性能產(chǎn)生更大幅度變化。

GS對(duì)NH4+有著高度的親和性，可以催化低濃度的NH4+同化。本研究發(fā)現(xiàn)，2個(gè)品種低硝處理地上部和根系GS活性都顯著高于全硝處理，且GS活性整體隨著銨硝比的增加而增加，但地上部低硝處理比銨硝比50/50處理的增幅水平小于銨硝比50/50處理比全硝處理的增幅。這可能存在3個(gè)方面的原因，（1）NH4+經(jīng)GS催化合成的谷氨酰胺對(duì)GS具有負(fù)反饋?zhàn)饔?，谷氨酰胺含量達(dá)到一定程度時(shí)能夠下調(diào)GS活性;（2）低硝處理下NH4+作為底物，濃度趨于飽和時(shí)，單位時(shí)間內(nèi)同化NH4+的增速減慢;（3）在同化NH4+的過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生H+，使細(xì)胞內(nèi)pH值下降，進(jìn)而抑制GS活性。另外，與全硝處理相比，硝響應(yīng)度強(qiáng)煙草品種NC89低硝處理GS活性增幅明顯大于中煙100;在全硝處理下，NC89地上部GS活性明顯低于中煙100。可見(jiàn)GS活性因品種硝響應(yīng)度的不同而有很大差異。在后續(xù)研究中，可通過(guò)測(cè)定GS相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)進(jìn)一步探究煙草GS活性對(duì)不同銨硝配比的響應(yīng)機(jī)制。

GDH作為氮素代謝過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，它能夠催化合成或分解谷氨酸。汪健飛研究表明，GDH的主要功能在于分解谷氨酸[20]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，GDH能夠促進(jìn)大豆吸收利用銨態(tài)氮[21]。本研究結(jié)果表明，中煙100和NC89不同處理下地上部GDH活性沒(méi)有顯著差異，與全硝處理相比，銨硝比50/50處理根系中GDH活性具有較大幅度的提高。說(shuō)明外源NH4+能夠有效誘導(dǎo)GDH活性的提高，且在NH4+濃度較高時(shí)，GDH活性的提高有利于降低NH4+在植物體內(nèi)的濃度。與中煙100相比，硝響應(yīng)度強(qiáng)煙草品種NC89各處理GDH活性較低，這可能是其在不同硝營(yíng)養(yǎng)下響應(yīng)強(qiáng)烈的原因之一。

宋文靜研究發(fā)現(xiàn)，與全NH4+營(yíng)養(yǎng)相比，增NO3-營(yíng)養(yǎng)處理顯著增加了水稻地上部、韌皮部以及根系中的生長(zhǎng)素含量[22]，說(shuō)明增硝營(yíng)養(yǎng)促進(jìn)了生長(zhǎng)素的合成以及向根系的極性運(yùn)輸。盧穎林在研究番茄增硝營(yíng)養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著營(yíng)養(yǎng)液中NH4+的增加，番茄木質(zhì)部傷流液中的細(xì)胞分裂素（CTK）和IAA總累計(jì)量顯著降低[23]。以上研究結(jié)果說(shuō)明，植物內(nèi)源生長(zhǎng)素對(duì)不同銨硝營(yíng)養(yǎng)存在不同響應(yīng)。在本試驗(yàn)中，與銨硝比50/50處理相比，不同硝響應(yīng)度煙草品種全硝處理和低硝處理根系生長(zhǎng)素含量均有所下降，其中低硝處理地上部和根系中的降幅均達(dá)到顯著水平。在2品種之間，NC89全硝、低硝處理根系中生長(zhǎng)素含量降幅較大。由于生長(zhǎng)素外輸載體（PIN）家族在根系生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸過(guò)程中起到重要作用，因此在后續(xù)研究中，可對(duì)PIN家族基因進(jìn)行PCR分析，研究其表達(dá)差異，明確在不同銨硝營(yíng)養(yǎng)下煙草內(nèi)源生長(zhǎng)素存在響應(yīng)差異且品種間存在響應(yīng)差異的機(jī)制。

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