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    1株大蒜內(nèi)生真菌的分離鑒定及抗病原真菌活性

    2019-08-20 13:46:50范飛李樂溪鞠秀云蘇奕人蔣繼宏楊緒勤
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2019年9期
    關(guān)鍵詞:分離純化大蒜

    范飛 李樂溪 鞠秀云 蘇奕人 蔣繼宏 楊緒勤

    摘要:大蒜(Allium sativum L.)為百合科蔥屬多年生草本植物,富含生物活性成分及營養(yǎng)物質(zhì)。采用組織分離法對新鮮健康的大蒜蒜瓣進行內(nèi)生真菌的分離純化,獲得一株乳白色真菌KLBMPGC013;通過形態(tài)特征和ITS序列分析鑒定該菌株為白地霉(Geotrichum candidum);將該菌株菌懸液接種在健康大蒜蒜瓣上進行培養(yǎng),大蒜蒜瓣未出現(xiàn)明顯病斑,說明該菌株對大蒜無致病性影響;以4種植物病原真菌為指示真菌檢測該菌株的抑菌活性,結(jié)果顯示,該菌株能抑制2種指示真菌的生長;采用蒽酮硫酸法檢測該菌株產(chǎn)胞外多糖含量,結(jié)果顯示,其胞外多糖濃度為2.89 mg/mL。通過提取該菌株胞外粗多糖并檢測其抑菌活性發(fā)現(xiàn),該內(nèi)生真菌粗多糖對大蒜白腐小核菌的抑制作用較好,對西瓜殼二孢稍有抑制作用。

    關(guān)鍵詞:大蒜;白地霉;抗病原真菌活性;分離純化;ITS序列分析

    中圖分類號:S182 文獻標志碼: A

    文章編號:1002-1302(2019)09-0156-04

    植物內(nèi)生真菌是生活在健康植物組織內(nèi)部并不表現(xiàn)出外在癥狀的微生物,它們從寄主植物上獲得營養(yǎng)和保護,而寄主植物可以從增強的競爭能力和對草食動物、病原體和各種非生物脅迫的抗性中受益,具有豐富的生物多樣性[1-2]。植物內(nèi)生真菌已知的種類繁多,而且還有許多植物內(nèi)生真菌有待開發(fā)和研究,是新型的藥物資源,具有潛在的應(yīng)用價值。近年來的研究表明,幾乎所有植物體內(nèi)都存在著內(nèi)生真菌,它們主要生長在植物的根、莖、葉、果實和種子等器官的皮下組織中。植物內(nèi)生真菌和宿主植物協(xié)同進化、互惠共生[3-4],它們可以產(chǎn)生大量對現(xiàn)代醫(yī)學、農(nóng)業(yè)和工業(yè)有潛在應(yīng)用價值的次生代謝產(chǎn)物,包括新型抗生素、抗藥物、免疫制劑和抗癌化合物等[5-6]。汪涯等從蛇足石杉葉片中分離的內(nèi)生真菌產(chǎn)生的黃曲霉具有抗老年癡呆和顯著提高記憶力的功效[7]。一些藥用植物內(nèi)生真菌還可以產(chǎn)生抗腫瘤活性物質(zhì),研究人員從白苞蒿[8]、堿蓬[9]、海南粗榧[10]等藥用植物中分離出了能產(chǎn)生抗腫瘤活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌。

    大蒜(Allium sativum L.)屬于百合科蔥屬,有“天然抗生素”的美稱,是重要的藥食同源植物[11]。大蒜中含有豐富的大蒜素、大蒜多糖、蒜氨酸酶等對人體健康十分有益的成分,已有研究證明,大蒜具有降血脂、降血糖、增強免疫力、防癌抗癌、延緩衰老等重要的生理功能,且在食品、藥品以及化妝品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用潛力[12-13]。目前,關(guān)于大蒜的研究熱點主要集中在大蒜提取物和殺菌抑菌方面,而對大蒜內(nèi)生真菌的研究還有待深入。本研究從新鮮大蒜蒜瓣中分離得到一株內(nèi)生真菌,研究該真菌抑制植物病原菌活性以及產(chǎn)胞外多糖的能力,提取該真菌胞外粗多糖并檢測其抑菌活性。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 植物樣品

    本試驗所用大蒜采自江蘇省徐州市邳州市宿羊山鎮(zhèn)大蒜種植基地。本試驗所用大蒜個頭大、品質(zhì)好、肉質(zhì)脆、無蟲孔及病害癥狀,有地域特色,具有說服力。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    分離純化培養(yǎng)基——馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基配方:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,去離子水1 L,瓊脂20 g,pH值自然。

    對照培養(yǎng)基——LB固體培養(yǎng)基配方:胰蛋白胨10 g,NaCl 10 g,酵母浸出粉5 g,去離子水1 L,瓊脂20 g,pH值為7.0~7.2。

    富集培養(yǎng)基——馬鈴薯葡萄糖(PD)液體培養(yǎng)基配方:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,去離子水1 L,pH值自然。

    1.1.3 目標菌株 試驗所用植物病原真菌有白腐小核菌(Sclerotium cepivorum Berk.)、茄鏈格孢(Alternaria solani)、蘋果輪紋病菌(Physalospora piricola)、西瓜殼二孢(Ascochyta citrullina Smith),均由江蘇師范大學江蘇省藥食植物生物技術(shù)國家重點實驗室提供。

    1.1.4 Sevag試劑的配制 三氯甲烷與正丁醇體積比為 4 ∶1。

    1.1.5 試驗儀器

    GC-250型恒溫光照培養(yǎng)箱(上海悅豐儀器儀表有限公司);HZP-250型全溫振蕩培養(yǎng)箱(上海福瑪實驗設(shè)備有限公司);UV-8000A型雙光束紫外可見分光光度計;DC-52生物顯微鏡。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 大蒜內(nèi)生真菌的分離純化

    采用組織切塊法對大蒜進行內(nèi)生真菌分離[14]。將新鮮大蒜去皮后,用去離子水沖洗10 min,在無菌環(huán)境下將大蒜用次氯酸鈉溶液浸泡5 min,75%乙醇漂洗20 s,無菌生理鹽水沖洗2次,無菌水沖洗1次。取最后1次沖洗的無菌水100 μL涂布在LB固體培養(yǎng)基上,37 ℃下培養(yǎng)1 d,如無菌生長,表明表面消毒成功,可進行后續(xù)試驗。將經(jīng)過表面消毒處理的大蒜樣品在無菌環(huán)境下切成約0.5 cm3的小組織塊,均勻嵌插進PDA培養(yǎng)基中,28 ℃下培養(yǎng)7~10 d后,從分離平板上挑取真菌菌落接種在新的分離純化培養(yǎng)基上,28 ℃下培養(yǎng)3~5 d。反復(fù)進行純化培養(yǎng),直至獲得單一菌株,進行常規(guī)保種、備用。

    1.2.2 菌種鑒定

    將分離得到的1株可產(chǎn)生胞外多糖的菌株在PDA培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),觀察菌落特征。挑取該菌株純培養(yǎng)產(chǎn)孢的內(nèi)生真菌制片,在顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。提取該菌株總DNA,采用ITS全序列通用引物進行PCR擴增,產(chǎn)物測序后將ITS全序列在NCBI網(wǎng)站中進行Blast比對分析;用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.2.3 菌株潛在致病性測定

    將培養(yǎng)5 d的菌株用無菌水制成菌懸液,在550 nm處測定吸光度。將新鮮健康的大蒜蒜瓣以分離內(nèi)生菌的方式進行表面消毒。在無菌環(huán)境下用消毒刀片在大蒜蒜瓣上橫向劃3道刀口,分別涂上該菌株菌懸液,以無菌水作對照[15]。在無菌培養(yǎng)皿中平鋪脫脂棉,噴無菌水保濕,將處理過的蒜瓣鋪在培養(yǎng)皿上培養(yǎng),共作5個平行樣。28 ℃下培養(yǎng)7 d,每天觀察蒜瓣變化,是否出現(xiàn)病變。

    1.2.4 抑菌活性檢測

    以白腐小核菌、茄鏈格孢、蘋果輪紋病菌、西瓜殼二孢4種植物致病真菌為指示真菌,用0.5 cm打孔器制成菌餅。利用平板對峙法,挑取一塊菌餅放置在PDA培養(yǎng)基一側(cè),在距離菌餅3 cm處接種“1.2.2”節(jié)中的內(nèi)生真菌,于 28 ℃ 培養(yǎng)5~7 d,觀察內(nèi)生真菌是否抑制指示真菌生長。

    1.2.5 胞外多糖含量測定——蒽酮硫酸法

    胞外多糖的制備:挑取一塊菌體于300 mL PD液體培養(yǎng)基中,28 ℃搖床培養(yǎng)2 d制成種子液。分別吸取1%種子液于500 mL PD液體培養(yǎng)基中,28 ℃搖床培養(yǎng)7 d,共發(fā)酵10 L。將發(fā)酵液于離心機中4 000 r/min離心5 min,得到的上清液即是含胞外多糖的溶液。

    葡萄糖標準曲線制作:準確稱取葡萄糖0.01 g溶于 100 mL 去離子水中,制備葡萄糖標準品溶液;準確稱取0.1 g蒽酮溶于50 mL濃硫酸中,制備蒽酮硫酸溶液。從葡萄糖標準品溶液中分別吸取50、100、200、300、400、600、800 μL,置具塞刻度試管中,分別加去離子水定容至1 mL。以葡萄糖溶液 ∶蒽酮硫酸溶液(體積比)為1 ∶3的比例在每瓶葡萄糖溶液中加入3 mL蒽酮硫酸溶液。搖勻后100 ℃水浴加熱 15 min,取出后迅速冷卻至室溫。以去離子水為空白對照,在最大吸收波長(620 nm)處測定相應(yīng)的吸光度,每個濃度測3次。以吸光度為縱坐標、葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標繪制葡萄糖標準曲線。

    待測菌株胞外多糖溶液的配制:吸取50 μL內(nèi)生真菌胞外多糖溶液溶于950 μL去離子水中,稀釋20倍,然后加入 3 mL 蒽酮硫酸溶液混勻,共測3個平行樣。

    胞外多糖含量的測定:將待測溶液于100 ℃條件下水浴中加熱15 min,取出后迅速冷卻至室溫。以去離子水為空白對照,在最大吸收波長(620 nm)處測定相應(yīng)的吸光度,并通過繪制的葡萄糖標準曲線計算該內(nèi)生真菌胞外多糖含量。

    1.2.6 內(nèi)生真菌胞外多糖的粗提取

    收集胞外多糖溶液,將10 L體積溶液濃縮至1 L。加入4倍體積的95%乙醇混合后靜置一夜,之后離心,保留沉淀。用5體積的去離子水將沉淀復(fù)溶、離心,取上清。加入占該上清溶液體積1/4的Sevag試劑高速攪拌20 min后倒入分液漏斗中,待分層后留上清,并將該步驟重復(fù)3次。加入4倍體積的95%乙醇,用布氏漏斗過濾,保留沉淀。用95%乙醇在布氏漏斗上洗滌沉淀2次,自然揮發(fā)乙醇,即得到粗多糖。

    1.2.7 內(nèi)生真菌粗多糖的抑菌活性檢測

    取10 mg粗多糖溶于1 mL去離子水中,用0.22 μm濾頭過濾成無菌溶液。在PDA平板內(nèi)1側(cè)放置1枚無菌牛津杯,加入100 μL粗多糖溶液,在距離牛津杯3 cm處接種1塊植物病原菌菌餅,28 ℃下培養(yǎng)7 d,觀察內(nèi)生真菌粗多糖是否抑制指示真菌生長。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 大蒜內(nèi)生真菌的分離

    采用組織切塊法對大蒜蒜瓣進行內(nèi)生真菌分離,在進行反復(fù)純化后共獲得純培養(yǎng)內(nèi)生真菌9株,發(fā)現(xiàn)其中1株真菌KLBMPGC013可產(chǎn)生胞外多糖,因此將該菌株作為進一步研究的大蒜內(nèi)生真菌菌株。

    2.2 菌株鑒定

    2.2.1 形態(tài)特征

    由圖1可知,菌株KLBMPGC013在PDA培養(yǎng)基上生長狀況良好,菌株為乳白色,絨毛狀,孢子發(fā)達。通過光學顯微鏡觀察該菌株孢子形狀為橢圓形(圖2)。

    2.2.2 菌株的分子鑒定

    將內(nèi)生真菌KLBMPGC013的ITS序列測定結(jié)果提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中,登錄號為KY103456.1。將菌株KLBMPGC013的DNA序列與GenBank中相關(guān)序列進行Blast序列相似性比對,采用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,對其進行分析。由圖3可知,菌株KLBMPGC013與白地霉(Geotrichum candidum)的進化距離最近,因此鑒定該菌株為白地霉。

    2.3 內(nèi)生真菌潛在致病性分析

    在培養(yǎng)過程中,每天對經(jīng)過KLBMPGC013菌株菌懸液涂抹的蒜瓣刀口進行觀察,7 d后觀察發(fā)現(xiàn),5組樣品與對照一樣,并未出現(xiàn)異常病斑(圖4)。

    將蒜瓣刀口處做切片處理,在光學顯微鏡下觀察,結(jié)果(圖5)發(fā)現(xiàn),對照蒜瓣切片與接菌蒜瓣切片相比無明顯差異,這均說明該菌株對大蒜無致病性。

    2.4 內(nèi)生真菌抑菌活性檢測

    通過平板對峙法觀察菌株KLBMPGC013對4種指示真菌生長的抑制效果,發(fā)現(xiàn)該菌株可抑制白腐小核菌的生長,并出現(xiàn)抑菌圈;對西瓜殼二孢的抑制作用較小,而對蘋果輪紋病菌和茄鏈格孢無抑制作用(圖6為菌株KLBMPGC013對大蒜白腐小核菌的抑制作用)。

    2.5 內(nèi)生真菌胞外多糖含量測定結(jié)果

    根據(jù)葡萄糖標準曲線y=11.783 0x+0.030 8,r2=0.990 6,計算得到該菌株產(chǎn)多糖含量較高,為2.89 mg/mL。

    2.6 內(nèi)生真菌胞外粗多糖抑菌活性檢測結(jié)果

    通過平板對峙法觀察菌株KLBMPGC013胞外粗多糖對4種指示真菌生長的抑制效果,結(jié)果顯示,該菌株胞外粗多糖對大蒜白腐小核菌的抑制作用較好,對西瓜殼二孢稍有抑制效果,而對蘋果輪紋病菌和茄鏈格孢無抑制作用(圖7為菌株KLBNPGC013胞外粗多糖對大蒜白腐小核菌和西瓜殼二孢的抑制作用)。

    3 結(jié)論與討論

    本研究通過對新鮮大蒜的內(nèi)生真菌進行分離純化,獲得9株內(nèi)生真菌,通過篩選獲得1株產(chǎn)胞外多糖的真菌菌株KLBMPGC013。結(jié)合菌株KLBMPC013的表型特征,經(jīng)ITS序列分析,將該菌株鑒定為白地霉。本研究發(fā)現(xiàn),該菌株對大蒜無致病性影響且對2種植物病原真菌有抑制效果。由于該真菌產(chǎn)胞外多糖含量較高,因此提取該菌株胞外粗多糖并檢測其抑菌活性,結(jié)果表明,該菌株具有抑菌活性是因為其胞外粗多糖具有抑菌效果。由于植物內(nèi)生真菌具有穩(wěn)定的生存空間、不易受外界影響,能直接作用于病原菌,在生物防治領(lǐng)域占有重要地位。因此對于KLBMPGC013菌株抑制植物病原真菌的效果,在后續(xù)研究中可以通過盆栽試驗來進行更加準確地檢測。此外,對于該菌株胞外多糖的其他生物活性也可以進行檢測和深入研究。

    很多藥用植物具有豐富的生物多樣性,是人類開發(fā)利用的重要資源。植物內(nèi)生菌與藥用植物的協(xié)同進化關(guān)系決定了某些內(nèi)生菌具有產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的生物活性物質(zhì)的能力[16]。植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的活性物質(zhì),在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生物制藥和食品發(fā)酵等方面都表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景,受到廣泛關(guān)注。白地霉菌具有許多可利用的價值,其菌體蛋白營養(yǎng)價值很高,可食用、可作飼料,也可提取核酸,還可以合成脂肪。Boutrou等研究表明,白地霉多樣的代謝途徑在奶酪的成熟過程中起重要作用,并通過酶活性促進奶酪風味的發(fā)展[17]。劉天明等利用白地霉發(fā)酵產(chǎn)品對小鼠進行急性毒性試驗、骨髓細胞微核試驗、小樹精子畸形試驗和30 d喂養(yǎng)試驗,結(jié)果表明,白地霉菌株發(fā)酵產(chǎn)品具有較好的飲用安全性[18]。Assas等利用阿達瑪矩陣研究發(fā)現(xiàn),在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下,白地霉菌對橄欖油廢水中化學需養(yǎng)量(COD)的去除率達到70%,而且廢液中部分多酚化合物也被氧化降解[19]。白地霉可用于白酒生產(chǎn),使原酒口感純正、甘甜、柔軟,品質(zhì)得到顯著改善[20]。白地霉作為一種極具潛力的菌種在多個領(lǐng)域都有開發(fā)利用價值,正確地運用它、挖掘它,可為我們的社會帶來巨大的經(jīng)濟效益。

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