山東銀蓮花葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)對(duì)異質(zhì)生境和海拔變化的響應(yīng)

于文英,高 燕,逄玉娟,王 鷙,卞福花,*

1 煙臺(tái)大學(xué)光電信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 煙臺(tái) 264005 2 煙臺(tái)市昆崳山林場(chǎng), 煙臺(tái) 264112 3 煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 煙臺(tái) 264005

全球變暖和日益增加的水資源短缺是農(nóng)林業(yè)可持續(xù)發(fā)展面臨的兩個(gè)重大問(wèn)題,植物如何適應(yīng)復(fù)雜多變的自然環(huán)境一直是植物學(xué)家們致力研究的核心與重點(diǎn)[1]。生物適應(yīng)環(huán)境同時(shí)影響環(huán)境,二者相互影響、相互依賴、相輔相成,在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中,逐步形成了各種有效適應(yīng)環(huán)境的機(jī)制。研究植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)策略對(duì)其保護(hù)、栽培和引種等都具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

山東銀蓮花(Anemoneshikokiana(Makino) Makino)是膠東半島和日本四國(guó)島特有、狹域、間斷分布的極小種群。在中國(guó)間斷分布于山東昆崳山和嶗山,包含兩個(gè)典型的異質(zhì)環(huán)境：如昆崳山海拔650—800 m濕潤(rùn)、陰暗的針闊混交次生林和海拔800 m以上干旱、強(qiáng)光照的山頂灌叢[2]。異質(zhì)的生境中細(xì)胞學(xué)水平、DNA水平和蛋白質(zhì)水平具有較高的多樣性[3- 5],表明該物種對(duì)兩種差異明顯的生境表現(xiàn)出極強(qiáng)的適應(yīng)性。山東銀蓮花僅有地下根狀莖,無(wú)地上莖,只有基生葉,葉片是植物進(jìn)行光合作用以及與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)、能量交換的主要器官,因此葉片是該種響應(yīng)異質(zhì)生境的最佳部位,研究葉片的外部形態(tài)及其內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)的變化對(duì)揭示其適應(yīng)策略具有重要意義,為將來(lái)研究其適應(yīng)機(jī)制提供基礎(chǔ)。

本研究通過(guò)對(duì)不同海拔、不同生境中山東銀蓮花葉片外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征的研究,揭示該種植物對(duì)不同海拔和異質(zhì)生境的響應(yīng)機(jī)制,為將來(lái)分子水平上揭示其適應(yīng)機(jī)制打下基礎(chǔ),以達(dá)到更好的保護(hù)和利用之目的。

1 取樣地點(diǎn)與策略

昆崳山位于山東省東部的膠東半島,屬于暖溫帶季風(fēng)氣候,兼有海洋性氣候,四季分明,季風(fēng)顯著,雨量充沛,空氣濕潤(rùn),光照充足。年平均氣溫11—12℃,年降雨量800—1000 mm,主要集中在6—9月,全年無(wú)霜期200 d左右,最高海拔為923 m,植被類型為暖溫帶落葉闊葉林。

山東銀蓮花在昆崳山多見(jiàn)于680 m以上針闊混交林下和山頂灌叢,自700 m開始,海拔梯度每垂直升高50 m設(shè)置一條樣帶,共5個(gè)樣帶：700、760、800、850、900 m,前3個(gè)代表林下生境,后兩個(gè)代表山頂生境。每條樣帶內(nèi)平行隨機(jī)選取多年生植株3—5棵,每棵采集一片相同位置、成熟、沒(méi)有明顯病菌癥狀或者動(dòng)物咬噬的葉片,編號(hào)、裝入自封袋,當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室,冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)選擇每棵植株上另一片相同位置的葉片,自中部剪取2—3個(gè)1 cm×1 cm小塊,直接放入FAA固定液中固定保存,用于石蠟包埋切片和葉片上、下表皮及氣孔觀察。

2 研究方法

2.1 山東銀蓮花葉片形態(tài)學(xué)研究

2.1.1 葉片表面附屬結(jié)構(gòu)的差異

用leica體視顯微鏡系統(tǒng)觀察不同生境內(nèi)不同海拔山東銀蓮花葉片背、腹兩面的附屬結(jié)構(gòu),自葉緣至葉片中部隨機(jī)選擇3個(gè)區(qū)域,每個(gè)區(qū)域觀察3個(gè)視野,拍照并用系統(tǒng)自帶軟件統(tǒng)計(jì)其長(zhǎng)短、大小、密度等。

2.1.2 葉片形態(tài)的差異

掃描儀掃描葉片,同時(shí)加標(biāo)尺作為葉片長(zhǎng)寬參照,保存圖像。利用ImageJ圖像處理軟件測(cè)定葉片的長(zhǎng)、寬和面積。最后將葉片放入65℃烘箱直至恒重,用萬(wàn)分位的電子天平稱其干重,計(jì)算比葉面積,比葉面積=葉面積/葉干重。

2.2 山東銀蓮花葉片解剖結(jié)構(gòu)的研究

2.2.1 氣孔及表皮細(xì)胞的差異

取FAA中固定的葉片小塊,用清水沖洗后,放入10%的次氯酸鈉溶液中浸泡至葉片發(fā)白,取出并用蒸餾水清洗,采用離析刮制法制取葉片上、下表皮,進(jìn)行酒精梯度脫水、二甲苯透明、染色,制成臨時(shí)裝片,顯微鏡觀察、拍照。

隨機(jī)選擇3個(gè)視野,分別統(tǒng)計(jì)上、下表皮氣孔數(shù)量和表皮細(xì)胞數(shù)量,用顯微系統(tǒng)自帶軟件計(jì)算上、下表皮的氣孔密度(個(gè)/mm2)、表皮細(xì)胞密度(個(gè)/mm2)；計(jì)算氣孔指數(shù),氣孔指數(shù)=100×氣孔密度/(氣孔密度+表皮細(xì)胞密度)；每個(gè)視野隨機(jī)選擇3個(gè)氣孔放大拍照,顯微鏡自帶測(cè)量系統(tǒng),同時(shí)目鏡測(cè)微尺輔助測(cè)其長(zhǎng)、寬,計(jì)算相對(duì)開度,氣孔相對(duì)開度=氣孔寬/氣孔長(zhǎng)。

2.2.2 葉肉組織的差異

常規(guī)石蠟包埋組織切片,顯微鏡觀察,隨機(jī)選擇3個(gè)視野拍照。顯微鏡自帶測(cè)量系統(tǒng),同時(shí)目鏡測(cè)微尺輔助測(cè)量葉片厚度、上下表皮厚度、柵欄組織和海綿組織厚度,每項(xiàng)每個(gè)視野測(cè)量三次。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

所有數(shù)據(jù)用Excel記錄整理,并計(jì)算平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差,SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

3 結(jié)果與分析

3.1 葉片表面附屬結(jié)構(gòu)

利用體視鏡觀察發(fā)現(xiàn),山東銀蓮花葉片背面的表皮毛分布均勻,纖細(xì)、不分枝；葉片腹面的表皮毛短、硬,分布不均勻,主要密集于葉脈,尤其是較大的葉脈內(nèi)側(cè),朝向于一個(gè)方向,非葉脈處毛稀疏、細(xì)且短。

圖1是5個(gè)海拔梯度樣帶內(nèi)山東銀蓮花背、腹兩面表皮毛長(zhǎng)短和密度的比較。由圖可知,葉片背面毛的長(zhǎng)度長(zhǎng)于葉片的腹面,與海拔差異無(wú)關(guān)。腹面毛長(zhǎng)度隨海拔升高而略微縮短,700 m處表皮毛明顯最長(zhǎng)；背面毛的長(zhǎng)度與海拔沒(méi)有明顯的關(guān)系。腹面表皮毛密度850 m以上表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)；背面表皮毛密度在800 m以下逐漸增加,850 m下降并趨于平穩(wěn)。

700—800 m林下和850—900 m山頂兩種不同生境中,葉片背面毛的長(zhǎng)度總是長(zhǎng)于葉片的腹面,林下(700、760、800 m)葉片腹面表皮毛比山頂(850、900 m)腹面表皮毛長(zhǎng)；林下葉片表皮毛的密度背、腹兩面都略大于山頂?shù)拿芏?表明生境對(duì)表皮毛的影響大于海拔對(duì)它的影響。

圖1 不同海拔山東銀蓮花葉片表皮毛長(zhǎng)度和密度的比較Fig.1 Comparison of length and density of epidermal hairs in leaf blade of A. shikokiana from different elevation gradients

3.2 葉干重和比葉面積

從圖2可以看出,葉長(zhǎng)、寬、面積對(duì)不同生境和海拔變化不敏感,未表現(xiàn)出明顯的差異,山頂(850、900 m)葉面積與林下(700、760、800 m)葉面積大小差異不大,葉干重760 m以上隨海拔升高而增加,山頂葉干重明顯高于林下,比葉面積山頂明顯低于林下,并且差異性顯著(P<0.05)。

圖2 不同海拔山東銀蓮花葉片形態(tài)比較Fig.2 Comparison of leaf morphology of A. shikokiana from different elevation gradients

3.3 表皮氣孔

顯微觀察發(fā)現(xiàn),上、下表皮細(xì)胞形狀不規(guī)則、排列緊密、彼此嵌合。5個(gè)海拔梯度內(nèi)的葉片上表皮均沒(méi)有氣孔,下表皮具有無(wú)規(guī)則型的氣孔,同一生境不同海拔的葉片氣孔排列差別不明顯,山頂較林下氣孔排列緊密整齊(圖3)。

圖3 山東銀蓮花葉表皮比較Fig.3 Comparison of leaf epidermisesa. 混交林上表皮; b. 混交林下表皮; c. 灌從上表皮; d. 灌從上表皮

圖4是5個(gè)海拔梯度樣帶內(nèi)山東銀蓮花氣孔密度、氣孔相對(duì)開度和氣孔指數(shù)的比較。氣孔相對(duì)開度與海拔負(fù)相關(guān),隨海拔升高而減小,差異性顯著(P<0.05)；而氣孔密度和氣孔指數(shù)與海拔沒(méi)有明顯的相關(guān)性,差異性不顯著(P>0.05)。山頂與林下相比較,氣孔密度和氣孔指數(shù)有升高的趨勢(shì),表明山東銀蓮花氣孔對(duì)生境比對(duì)海拔的變化更敏感。

圖4 不同海拔山東銀蓮花葉片氣孔的比較Fig.4 Comparison of leaf stomata of A. shikokiana from different elevation gradients

3.4 葉片厚度

林下柵欄組織細(xì)胞排列不整齊、疏松,山頂柵欄組織仍是一層細(xì)胞,但是排列更加緊密、整齊,較林下更厚,海綿組織山頂較林下更加發(fā)達(dá)(圖5),同一生境內(nèi)不同海拔梯度的葉肉細(xì)胞差異不明顯。

圖6是5種海拔梯度樣帶內(nèi)山東銀蓮花葉片厚度、上下表皮厚度、柵欄組織和海綿組織厚度的比較。海拔變化對(duì)各單因素參數(shù)引起的差異不顯著(P>0.05),山頂與林下比較,葉片厚度、柵欄組織厚度和海綿組織厚度均增加,差異顯著；上下表皮厚度沒(méi)有明顯差異(P>0.05),表明表皮細(xì)胞對(duì)海拔變化和生境變化不敏感。山頂葉片加厚的主要因素在于葉肉組織的改變,尤其是海綿組織厚度的增加從而增加了葉片的厚度。

圖6 不同海拔山東銀蓮花葉片厚度的比較Fig.6 Comparison of the leaf thickness in A. shikokiana from different elevation gradients

4 討論

4.1 山東銀蓮花對(duì)異質(zhì)生境的響應(yīng)

植物適應(yīng)環(huán)境的選擇壓力是非常復(fù)雜的過(guò)程,為了適應(yīng)環(huán)境,必須調(diào)整自身的相應(yīng)機(jī)制,啟動(dòng)相關(guān)的信號(hào)系統(tǒng)滿足需要。葉片是植物暴露在空氣中進(jìn)行同化作用的主要器官,其組織結(jié)構(gòu)對(duì)周圍環(huán)境反應(yīng)敏銳,其形態(tài)結(jié)構(gòu)在外界生態(tài)因素的長(zhǎng)期作用下具有很大的變異性和可塑性,與植物生長(zhǎng)對(duì)策及利用資源的能力緊密相關(guān)[6]。針闊混交林下水分充足、營(yíng)養(yǎng)豐富,但是缺少光照,山頂灌叢光照充足,但是水分虧缺。山東銀蓮花為了適應(yīng)兩種不同的生活環(huán)境,葉片形態(tài)和內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出明顯的差異,以獲取最大利益滿足自身需求。

(1)比葉面積 比葉面積與植物相對(duì)生長(zhǎng)速率、光合速率、葉氮含量有關(guān),可用來(lái)反映植物的碳獲取策略,是生理過(guò)程權(quán)衡的最佳指標(biāo)[7]。比葉面積較大的植物葉片資源捕獲面積大,具有較高的凈光合速率,一般光照越弱、葉片越薄、單位面積的干重越小,比葉面積則越大。本研究混交林下的山東銀蓮花接受較弱的光照,具有明顯大于山頂?shù)谋热~面積,符合植物葉片適應(yīng)弱光照的一般規(guī)律。比葉面積較低的植物將更多的物質(zhì)用于構(gòu)建保衛(wèi)構(gòu)造或者增加葉肉細(xì)胞密度,可以有效的減小蒸騰和防止葉片過(guò)度失水[8],更好的適應(yīng)資源貧瘠和干旱的環(huán)境。山頂山東銀蓮花具有較低的比葉面積,一定程度上可以保持葉片水分,增強(qiáng)抗旱能力。

(2)葉片厚度 山頂?shù)纳綎|銀蓮花葉片增厚,尤其是柵欄組織的增厚能夠減少水分的散失；林下山東銀蓮花具有較薄的葉片以縮短光線到達(dá)葉綠體的距離,使其最大量地吸收微弱的光線滿足光合作用之所需。干旱條件下黃瓜葉片因柵欄組織和海綿組織厚度的減小使其總厚度減小[9],與本研究結(jié)果不一致。葉片厚度與資源獲取、水分保存和同化有關(guān),較厚的柵欄組織增加葉片內(nèi)部水分向葉片表面擴(kuò)散的距離和對(duì)水流的阻力,減小水的蒸騰,提高水的利用效率,更好的適應(yīng)干旱脅迫[10-11],這是對(duì)本研究山頂葉片厚度增加最好的解釋。

(3)氣孔 氣孔是植物適應(yīng)水分、光照的主要限制因子之一,是植物氣體交換的微型閥門,控制著空氣和水分的進(jìn)出,旱生植物的氣孔有助于植物在缺水時(shí)保持較高的光合速率[12- 14],表現(xiàn)在氣孔大小、密度、開度等方面。山頂植株氣孔密度增加,但是減小了氣孔大小甚至關(guān)閉從而減少過(guò)度蒸騰,與LIU等的研究結(jié)果一致[9]。林下的山東銀蓮花為了更加順暢的進(jìn)行氣體交換,滿足光合作用需要,并排出多余的水分,具有較大的氣孔相對(duì)開度以適應(yīng)林下的環(huán)境。

雖然山東銀蓮花葉片的多數(shù)特征表現(xiàn)出與生境的高度適應(yīng),但是,某些特征卻表現(xiàn)出與環(huán)境條件不匹配的“非適應(yīng)性”。

(1)表皮毛 林下植株為充分接受微弱的光照一般具有較短的表皮毛和較低的密度,山頂為減少蒸騰多具有較長(zhǎng)的表皮毛和較高的表皮毛密度,而實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻相反?？赡艿脑蚴侨~片背光面表皮毛對(duì)光照的影響不大,主要作用可能只是避免害蟲咬噬起保護(hù)作用；上表皮雖然接受陽(yáng)光照射,但是表皮毛主要密集于葉脈內(nèi)側(cè),而且短、硬、沿葉脈方向傾倒,不影響葉肉細(xì)胞接受光照。

(2)氣孔密度 山頂為保持水分多具有較低的氣孔密度,而本研究山頂氣孔密度較大,但是氣孔相對(duì)開度較低、光照較強(qiáng)的時(shí)間段多數(shù)關(guān)閉以減少水分的散失。有研究表明氣孔孔徑大小隨氣壓和溫度的升高而下降[15],本研究氣孔開度是否也受氣壓和溫度影響,有待進(jìn)一步研究。而且植物葉片氣孔密度越大,有利于短時(shí)間內(nèi)充分利用有效水分進(jìn)行光合作用[16]。多數(shù)植物在中度干旱脅迫下,氣孔密度增加,而在重度干旱脅迫下,氣孔密度減少[17-18],因此可能山頂只是處于中度干旱脅迫。Zhao等認(rèn)為水分虧缺刺激了氣孔生成,導(dǎo)致氣孔密度增加[19]。但Sam等認(rèn)為干旱脅迫下植物較高的氣孔密度與葉面積減小有關(guān)[20]。此外,楊惠敏和王根軒的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)干旱條件下,植物氣孔減小,密度增大,分布趨向均勻,在保持光合的同時(shí)減小水分的散失[21],與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。由此看出,各種植物適應(yīng)環(huán)境的特征和機(jī)制有共性也有其各自的特性,結(jié)果不具有普適性。

4.2 山東銀蓮花對(duì)海拔變化的響應(yīng)

海拔梯度包含了溫度、濕度、光照和土壤等諸多環(huán)境因子的劇烈變化,氣溫、氣壓、CO2濃度等環(huán)境因子隨海拔升高而降低,而光照強(qiáng)度則隨海拔升高而增加[22]。近年來(lái),通過(guò)海拔梯度上植物葉片性狀與環(huán)境因子相互關(guān)系來(lái)研究環(huán)境變化,已成為研究全球氣候變化的熱點(diǎn)之一[23-24]。

本研究只有葉片腹面表皮毛的長(zhǎng)度和氣孔相對(duì)開度與海拔梯度表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性,隨海拔升高而逐漸減小,更好地滿足其生活需要。其余葉片特征如柵欄組織和海綿組織厚度、氣孔密度、比葉面積等對(duì)海拔變化均未表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性,即對(duì)海拔變化不敏感?？赡艿脑蛟谟诒狙芯坑捎趦蓚€(gè)生境海拔相差不大,每個(gè)生境再分成不同的海拔梯度,可能對(duì)結(jié)果無(wú)明顯影響。

某些單一葉片特征與海拔不具有明顯的相關(guān)性,但是將兩個(gè)或多個(gè)特征因素綜合考慮,可以看出它們存在協(xié)同關(guān)系。如比葉面積與氣孔密度,二者對(duì)海拔變化均未表現(xiàn)出規(guī)律性變化,但是二者之間具有彼此消長(zhǎng)的關(guān)系,以此適應(yīng)不同環(huán)境。Romero-Munar等也發(fā)現(xiàn)葉片可塑性和氣孔調(diào)節(jié)相互協(xié)調(diào)、相互配合共同決定植物適應(yīng)水分脅迫的能力[25]。植物氣孔特征與葉片形態(tài)特征對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)存在一定的協(xié)同變異性,但這種關(guān)系不具有普適性,主要與氣孔特征和葉片功能性狀的選擇壓力存在差異以及物種分布相關(guān)[26]。

5 總結(jié)

生境復(fù)雜多變,生活在其中的植物改變生理、形態(tài)與結(jié)構(gòu)做出響應(yīng),通過(guò)多種性狀的組合來(lái)適應(yīng)變化的環(huán)境。植物對(duì)環(huán)境的響應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的、綜合的過(guò)程,是各個(gè)功能性狀相互協(xié)調(diào)、相互配合的過(guò)程。不同種植物或同一種植物葉片對(duì)環(huán)境中的生態(tài)因子敏感程度有所不同,對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)具有多樣性。

林下的山東銀蓮花具有更高的光合能力,山頂?shù)木哂懈玫乃掷眯屎捅Ｋ芰?都能有效協(xié)調(diào)碳同化和水分利用,表現(xiàn)出良好的適應(yīng)能力。

山東銀蓮花分布狹域、稀有、種群小,具有重要價(jià)值,存在兩種對(duì)比鮮明的異質(zhì)生境,是理想的研究生態(tài)適應(yīng)策略和適應(yīng)機(jī)制的非模式植物材料。對(duì)它的研究既能為今后的保護(hù)和利用服務(wù),同時(shí)為將來(lái)研究山東銀蓮花適應(yīng)性的分子機(jī)制打下基礎(chǔ),為其他植物的研究提供理論參考。