HPLC同步測(cè)定澤蘭配方顆粒指紋圖譜與咖啡酸、迷迭香酸含量

姚娜，黃燕明，李雪銀，陳桂生，康志英

(1.廣州市香雪制藥股份有限公司,廣東 廣州 510663；2.寧夏隆德縣六盤山中藥資源開發(fā)有限公司,寧夏 固原 756300)

澤蘭配方顆粒是以澤蘭飲片為原料，經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒及包裝等工藝制備而成。原料澤蘭為唇形科植物毛葉地瓜兒苗(LycopuslucidusTurcz.var.hirtus Regel)的干燥地上部分。澤蘭具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀消癰、利水消腫的作用，臨床上用于月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、痛經(jīng)、產(chǎn)后瘀血腹痛、瘡癰腫毒和水腫腹水[1-2]。澤蘭中的主要化學(xué)成分包括三萜酸類、酚酸類、黃酮類、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分等[3-5]，其中咖啡酸、迷迭香酸是主要的有效成分之一。主要藥理作用有降低血脂，防治肝損傷，鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜，增強(qiáng)子宮平滑肌收縮，利膽，抗菌，抗病毒和抗癌等[6-7]。為了有效控制和評(píng)價(jià)澤蘭配方顆粒的質(zhì)量，本研究采用HPLC法建立了同步測(cè)定澤蘭配方顆粒指紋圖譜并對(duì)指標(biāo)成分咖啡酸、迷迭香酸進(jìn)行了定量檢測(cè)的方法[8-11],現(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試藥

十萬(wàn)分之一電子分析天平(MS205DU，瑞士Mettler toledo公司)；超純水器(Simplicity，美國(guó)密理博Millipore公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；Ultimate 3000 DGLC高效液相色譜儀；Agilent 1260高效液相色譜儀。

澤蘭對(duì)照藥材(中山優(yōu)諾生物科技發(fā)展有限公司，UNO-002078，規(guī)格：1 g/瓶)；咖啡酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，110885-200102，純度：100%)；迷迭香酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，111871-201404，純度：98.6%)；乙腈、磷酸均為色譜級(jí)；甲醇為分析純。

10批澤蘭配方顆粒均來(lái)自廣州市香雪制藥股份有限公司(批號(hào)依次為01～10)；麥芽糊精來(lái)自中糧生化能源(公主嶺)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為325 nm。理論塔板數(shù)按咖啡酸、迷迭香酸計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

表1 梯度洗脫條件

2.2 參照物溶液的制備

取咖啡酸對(duì)照品、迷迭香酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含咖啡酸10 μg、迷迭香酸50 μg的混合溶液，混勻即得。

2.3 供試品溶液的制備

取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 測(cè)定法

分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖，即得。

2.5 10批樣品的檢測(cè)結(jié)果

分別取10批澤蘭配方顆粒，按“2.3”項(xiàng)下方法制備10份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，得到10批澤蘭配方顆粒的咖啡酸與迷迭香酸的總含量為2.387～2.720 mg/g，平均總含量為2.622 mg/g；得到10批澤蘭配方顆粒的色譜疊加圖見圖1，通過(guò)對(duì)10批的色譜圖進(jìn)行分析，有7個(gè)色譜峰能穩(wěn)定重現(xiàn)，故確立了7個(gè)共有峰，其中1號(hào)峰的保留時(shí)間及紫外光譜與咖啡酸對(duì)照吻合，4號(hào)峰的保留時(shí)間及紫外光譜與迷迭香酸對(duì)照品吻合，故供試品指紋圖譜中1號(hào)峰鑒定為咖啡酸，4號(hào)峰鑒定為迷迭香酸。

注:峰1：咖啡酸峰;S：迷迭香酸。圖1 10批澤蘭配方顆粒HPLC指紋圖譜疊加圖

2.6 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性試驗(yàn)

取澤蘭配方顆粒、麥芽糊精及澤蘭對(duì)照藥材分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，7個(gè)共有色譜峰的鑒定均不受溶劑及輔料等因素干擾，具有良好的專屬性。見圖2。

注:A：澤蘭配方顆粒;B：陰性對(duì)照;C：空白溶劑;D：澤蘭對(duì)照藥材。圖2 澤蘭配方顆粒指紋圖譜專屬性試驗(yàn)

2.6.2 精密度試驗(yàn)

取同一批澤蘭配方顆粒供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件于高效液相色譜儀上連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.1版)》進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示相似度均為1.000，表明儀器等整個(gè)系統(tǒng)的精密度良好。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批澤蘭配方顆粒樣品，平行6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.1版)》進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示相似度均為1.000，表明該分析方法的重復(fù)性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批澤蘭配方顆粒供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、24、48 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.1版)》進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示相似度均為1.000，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 中間精密度試驗(yàn)

分別考察不同分析人員、不同日期及不同設(shè)備對(duì)精密度的影響。結(jié)果,不同影響因素下各圖譜相似度均≥0.964，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間無(wú)明顯變化，表明該方法精密度良好，隨機(jī)變動(dòng)因素不影響該方法精密度。

2.6.6 耐用性實(shí)驗(yàn)

取同一批澤蘭配方顆粒供試品，分別使用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Elite Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm，5 μm)和Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)三種型號(hào)的色譜柱，測(cè)定澤蘭配方顆粒的指紋圖譜，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.1版)》進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示相似度均≥0.984。表明該方法耐用性良好。

2.7 含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.7.1 線性關(guān)系及范圍

取混合對(duì)照品溶液(咖啡酸濃度：10.27 μg/mL，迷迭香酸濃度：51.52 μg/mL)，采用自動(dòng)進(jìn)樣器分別進(jìn)樣0.1、5、1、2、5、10、15、20 μL，在325 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)定。即咖啡酸進(jìn)樣量為0.001、0.005 1、0.010 3、0.020 5、0.051 4、0.102 7、0.154、0.205 4 μg，以咖啡酸峰面積積分值A(chǔ)對(duì)咖啡酸對(duì)照品的進(jìn)樣量C進(jìn)行回歸分析，其回歸方程為：A=90.316C-0.012，相關(guān)系數(shù)r=1。結(jié)果表明,咖啡酸在0.001 0～0.205 4 μg范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。迷迭香酸進(jìn)樣量為0.005 2、0.025 8、0.051 5、0.103、0.257 6、0.515 2、0.772 8、1.030 4 μg，以迷迭香酸峰面積積分值A(chǔ)對(duì)迷迭香酸對(duì)照品的進(jìn)樣量C進(jìn)行回歸分析，其回歸方程為：A=50.781C-0.008，相關(guān)系數(shù)r=1。結(jié)果表明,迷迭香酸在0.005 2～1.030 4 μg范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系線性關(guān)系。

2.7.2 重復(fù)性試驗(yàn)

同“2.6.3”項(xiàng)下進(jìn)行含量測(cè)定，并對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，咖啡酸平均含量為0.39 mg/g，RSD為2.30%；迷迭香酸平均含量為2.27 mg/g，RSD為1.81%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

同“2.6.4”項(xiàng)下測(cè)定，對(duì)所得峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并計(jì)算RSD。咖啡酸對(duì)照品溶液和供試品溶液的RSD分別為0.62%、1.21%；迷迭香酸對(duì)照品溶液和供試品溶液的RSD分別是0.42%、0.6%，表明澤蘭配方顆粒供試品溶液及咖啡酸、迷迭香酸對(duì)照品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.4 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已測(cè)咖啡酸、迷迭香酸含量的澤蘭配方顆粒(平均含量分別為0.385 5 mg/g、2.267 mg/g)適量，平行9份，分別精密加入低、中、高濃度的咖啡酸、迷迭香酸對(duì)照品，按供試品項(xiàng)下操作，依法測(cè)定，咖啡酸、迷迭香酸平均回收率分別為99.2%，104.23%；RSD分別為1.23%，1.45%，結(jié)果表明該方法回收率良好。

2.7.5 中間精密度試驗(yàn)

同“2.6.5”項(xiàng)下測(cè)定，咖啡酸、迷迭香酸含量的RAD分別在0.84%～1.66%和0.13%～1.43%，表明該方法中間精密度良好。

2.7.6 耐用性試驗(yàn)

同“2.6.6”項(xiàng)下測(cè)定，咖啡酸、迷迭香酸含量的RSD分別為2.27%、1.02%，表明該方法耐用性良好。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，考察了乙腈-0.5%磷酸，乙腈-0.1%磷酸，乙腈-水等流動(dòng)相體系；全波長(zhǎng)掃描考察了不同波長(zhǎng)下供試品的指紋圖譜。嘗試了等度洗脫及多種梯度洗脫程序，最終選取在325 nm下，乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫，該條件下譜圖色譜峰信息豐富，分離度好，穩(wěn)定性好。

在咖啡酸、迷迭香酸含量測(cè)定中，對(duì)其定量下限進(jìn)行研究。混合對(duì)照品溶液(咖啡酸濃度：10.27 μg/mL，迷迭香酸濃度：51.52 μg/mL)適量，進(jìn)樣0.1 μL，依法測(cè)定?？Х人嵘V峰信噪比約為25∶1時(shí)，對(duì)應(yīng)的咖啡酸的量為0.001 μg，迷迭香酸的量為0.005 2 μg，連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積RSD分別為2.35%、0.92%，故本含量測(cè)定方法的咖啡酸、迷迭香酸的下限分別為0.001 μg和0.005 2 μg。

綜上所述，本試驗(yàn)中建立的采用HPLC同步測(cè)定澤蘭配方顆粒指紋圖譜與咖啡酸、迷迭香酸含量的方法穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，可為澤蘭配方顆粒質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供了參考。