益氣活血方對(duì)糖尿病大鼠心臟血管保護(hù)功能的機(jī)制研究

高永紅，張國(guó)杰

(1.河南康復(fù)中心醫(yī)院，河南 鄭州 450002；2.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004)

糖尿病[1](Diabetes mellitus，DM)是指由遺傳因素、飲食不平衡、內(nèi)分泌功能紊亂等多種致病因子共同作用，導(dǎo)致胰島素功能減退，生物作用障礙,并伴蛋白質(zhì)、糖、水、電解質(zhì)、脂肪等一系列代謝紊亂綜合征。糖尿病心臟血管病變是常見的慢性并發(fā)癥之一[2]，發(fā)病率是正常人群的3～5倍，其中冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是導(dǎo)致糖尿病患者死亡或傷殘的主要原因[3]，約占糖尿病死亡率80%，累及心肌細(xì)胞、心臟自主神經(jīng)、冠狀動(dòng)脈，臨床表現(xiàn)為心律不齊、心絞痛、心肌梗塞、心臟衰竭、甚至猝死。目前研究認(rèn)為糖尿病心臟血管病變可能參與或加速冠狀動(dòng)脈粥樣硬化炎癥過程，但兩者間病理機(jī)制尚不明確。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,糖尿病心臟病屬于“消渴”“心痛”范疇[4]，DM患者嗜食肥甘厚味，飲食不節(jié)損傷脾胃，脾氣虛弱，病久不愈，正氣虧虛，痰濕內(nèi)生，又因外邪內(nèi)侵或情志難舒累及心絡(luò)，痰瘀互結(jié)，阻塞絡(luò)道，氣滯血瘀引發(fā)糖尿病心臟病，屬以氣血兩虛為本，痰瘀阻脈為標(biāo)的本虛標(biāo)實(shí)證。西醫(yī)多以降糖降脂、抗炎抗氧化等對(duì)癥治療，效果不理想療程長(zhǎng)，易產(chǎn)生耐藥性及不良反應(yīng)[5]，而中醫(yī)治療糖尿病由來已久，益氣活血方可益氣活血、滋陰生津，對(duì)于延緩改善糖尿病慢性并發(fā)癥、臨床癥狀有著極好的療效[6]，但益氣活血方與糖尿病心臟血管之間機(jī)制尚不明確，本研究旨在研究益氣活血方輔助治療對(duì)糖尿病大鼠模型心臟血管保護(hù)功能的機(jī)制，期望為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用成年健康SPF級(jí)雄性SD大鼠64只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證書11400700126477)，體質(zhì)量180～210 g，采用同種無菌飼料及滅菌純水投喂大鼠，環(huán)境溫度(24±2)℃之間，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(n=16)、造模組(n=48)，本研究上報(bào)動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)，且獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要藥物及試劑

自擬益氣活血方組方：黃芪、白術(shù)、茯苓、葛根、丹參、川芎和甘草(上海市藥材有限公司)，按照人與大鼠劑量換算比例進(jìn)行配置，制備成凍干粉，每克含生藥5 g；辛伐他汀(北京萬生藥業(yè)有限責(zé)任公司)；鏈脲佐菌素(華中海威北京基因科技有限公司)；MCP-1及ICAM-1免疫組化染色試劑盒(上海雅吉生物科技)；水合氯醛(南京邦諾生物科技有限公司)；超敏C反應(yīng)蛋白試劑盒(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司)；0.9%NaCl溶液(北京北生研生物制品有限公司)；HE染色試劑盒(北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司)；10%福爾馬林(上海譜振生物科技有限公司)；枸櫞酸鈉緩沖液(赫澎生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽?/h3>

造模組48只大鼠均給予1%鏈脲佐菌素(STZ)檸檬酸緩沖液(STZ、0.1 M檸檬酸鈉緩沖液配成1%濃度，pH值4.2無菌檸檬酸緩沖液)，按60 mg/kg注射于腹腔；對(duì)照組大鼠給予相同劑量檸檬酸鈉緩沖液于腹腔注射。72 h后，取造模組大鼠鼠尾靜脈血，檢測(cè)血糖,血糖≥16.7 mmol/L即為造模成功。造模成功大鼠共42只，按完全隨機(jī)原則分為模型組(n=14)、聯(lián)合組(n=14)、西藥組(n=14)，西藥組以1.7 mg/kg給予辛伐他汀片灌胃，聯(lián)合組以31 g/kg自擬益氣活血方聯(lián)合1.7 mg/kg予辛伐他汀片灌胃，對(duì)照組及模型組每日給予相同體積生理鹽水灌胃，療程12周。

1.4 觀察項(xiàng)目

1.4.1 各組大鼠一般情況

每日觀察并記錄各組大鼠生長(zhǎng)情況、體質(zhì)量、毛色、活動(dòng)情況、精神狀態(tài)、飲食和排泄情況等。

1.4.2 生化指標(biāo)測(cè)定

大鼠成功麻醉后股動(dòng)脈采血，以強(qiáng)生血糖儀測(cè)定血糖(Blood glucose，GLU)，分離血清后使用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)膽固醇(Total Cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein cholesterol，HDL)和低密度脂蛋白(How density lipoprotein cholesterol，LDL)。

1.4.3 炎性因子測(cè)定

采血分離血清后取上清液采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測(cè)超敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)水平。步驟如下，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋和加樣，各孔加樣量均為50 μL，第1、2孔濃度為300 ng/L，第3、4孔濃度為200 ng/L，第5、6孔濃度為100 ng/L，第7、8孔濃度為50 ng/L，第9、10孔濃度為25 ng/L；設(shè)11、12孔為空白孔，不加樣品和酶標(biāo)試劑，其余操作相同，在酶標(biāo)包被板96孔加入40 μL樣品稀釋液和10 μL樣品；溫育30 min；洗滌拍干重復(fù)5次；除空白孔加酶標(biāo)試劑50 μL；溫育30 min；洗滌拍干重復(fù)5次；加顯色劑封板溫育15 min；加終止液上機(jī)測(cè)定。

1.4.4 組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞黏附因子-1(Intercellular cell adhesion molecule，ICAM-1)及單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)表達(dá)

第12周末次給藥后，禁食禁水12 h，麻醉處死各組大鼠進(jìn)行解剖。取胸主動(dòng)脈10%甲醛溶液固定，石蠟包埋成塊備用，采用蘇木精-伊紅(Hematoxylin eosin，HE)染色法。切成4 μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蘇木素染色，1%鹽酸溶液分化30 s，流水洗凈，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察HE染色結(jié)果。免疫組織化學(xué)法：石蠟4 μm切片，二甲苯脫蠟，抗原修復(fù)，3%雙氧水孵育10 min去除內(nèi)源性氧化物酶的活性，PBS沖洗5 min×3次，滴加正常山羊血清封閉20 min，滴加一抗工作液孵育60 min，4 ℃過夜，PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗工作液孵育37 ℃孵育20 min，PBS沖洗5 min×3次，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗5 min×3次，二氨基聯(lián)苯(Diaminobenzidine，DAB)顯色劑顯色2 min，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

對(duì)照組大鼠生長(zhǎng)速度正常，精神良好，毛發(fā)整齊有光澤，飲水、尿量無異常；模型組大鼠精神萎靡，毛發(fā)枯黃，明顯多食多飲多尿，消瘦，反應(yīng)遲鈍，部分大鼠出現(xiàn)下肢水腫癥狀；西藥組與聯(lián)合組均出現(xiàn)模型組類似表現(xiàn)，皆有一定程度改善，各組大鼠一般情況表現(xiàn)依次為模型組<西藥組<聯(lián)合組<對(duì)照組。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量情況及血糖水平

干預(yù)后模型組、西藥組、聯(lián)合組GLU均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，西藥組與模型組之間GLU無明顯差異(P>0.05)，聯(lián)合組GLU遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于模型組和西藥組(P<0.05)。干預(yù)前四組體質(zhì)量無明顯差異(P>0.05)，干預(yù)后模型組、西藥組、聯(lián)合組體質(zhì)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，西藥組與模型組之間體質(zhì)量無明顯差異(P>0.05)，聯(lián)合組體質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模型組和西藥組(P<0.05)，見表1。

2.3 各組大鼠血脂水平比較

模型組、西藥組TC、TG、LDL及聯(lián)合組TC顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，模型組HDL顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，西藥組及聯(lián)合組HDL與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)，聯(lián)合組TG、LDL與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)，西藥組TG、LDL顯著高于聯(lián)合組(P<0.05)，見表2。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化情況及血糖水平比較

注：*表示采用Kruskal-WallisH秩和檢驗(yàn)計(jì)算的H值。與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與西藥組比較，cP<0.05。

表2 各組大鼠血脂情況比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與西藥組比較，cP<0.05。

2.4 各組大鼠hs-CRP水平比較

模型組hs-CRP水平顯著高于西藥組、聯(lián)合組及對(duì)照組(P<0.05)，西藥組、聯(lián)合組及對(duì)照組之間hs-CRP水平比較無顯著差異(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠hs-CRP水平比較

注:與模型組比較,bP<0.05。

2.5 各組大鼠病理學(xué)比較

對(duì)照組細(xì)胞紋理清晰，排列整齊，胞漿著色均勻，內(nèi)皮細(xì)胞扁平，內(nèi)膜平坦，平滑肌細(xì)胞與彈力板近平行相間排列。模型組細(xì)胞排列紊亂，內(nèi)皮細(xì)胞突起，內(nèi)膜增厚，平滑肌細(xì)胞增生，病灶處彈力板呈波浪狀或交織狀排列，可見斷裂分離。聯(lián)合組及西藥組的組織形態(tài)變化與模型組類似，但較模型組有所好轉(zhuǎn)，其中聯(lián)合組優(yōu)于西藥組，見圖1。模型組、西藥組、聯(lián)合組ICAM-1及MCP-1表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，聯(lián)合組ICAM-1及MCP-1表達(dá)顯著低于模型組、西藥組(P<0.05)，見圖2、圖3和表4。

圖1 病理組織學(xué)比較(HE,×400)

圖2 各組ICAM-1表達(dá)情況(HE,×200)

圖3 各組MCP-1表達(dá)情況(HE,×200)

表4 各組大鼠免疫組織化學(xué)比較

注:與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與西藥組比較，cP<0.05。

3 討論

隨著人口不斷趨于老齡化和肥胖化，受生活習(xí)慣和生活壓力雙重影響[7]，糖尿病病患人數(shù)快速增加，國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)報(bào)告指出，到2025年世界糖尿病患者可能升至38億，并將每年11月14日定為“世界糖尿病日”。糖尿病分為1型和2型糖尿病，1型糖尿病[8]是由于基因、病毒或自身免疫體統(tǒng)破壞產(chǎn)生胰島素的胰腺胰島β細(xì)胞，導(dǎo)致自身無法生產(chǎn)足夠胰島素或根本無法生產(chǎn)胰島素，目前對(duì)于此病沒有治愈方法，但可以通過胰島素注射維持正常生活。2型糖尿病[9]由于胰島素抵抗作用異?；蛞蚋鞣N原因細(xì)胞對(duì)胰島素沒有反應(yīng)導(dǎo)致胰島素分泌遲緩不足，不能正常發(fā)揮生理作用。DM患者持續(xù)慢性高血糖環(huán)境及其他危險(xiǎn)因素導(dǎo)致代謝紊亂，累及眼、腎、心腦血管等，最終導(dǎo)致器官功能障礙衰竭，糖尿病性心臟病[10]作為糖尿病的主要致死原因，病理改變包括心肌細(xì)胞纖維化、心肌肥大凋亡及血管病變等，其中血管病變導(dǎo)致的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病約占糖尿病死亡率80%，主要因?yàn)殚L(zhǎng)期血糖偏高，化學(xué)物質(zhì)破壞血管壁，血管失去彈性逐漸硬化，白細(xì)胞在趨化因子作用下進(jìn)入內(nèi)膜，釋放炎性因子，血脂斑塊、纖維蛋白、血小板在受損處聚集黏附，動(dòng)脈硬化增厚，導(dǎo)致血管管腔狹窄，血液流通不暢，心肌無法獲得充足血液及氧氣，造成心臟病[11]。目前西醫(yī)采用胰島素、二甲雙胍類、α-葡萄糖苷酶抑制劑、噻唑烷二酮類等藥物進(jìn)行降糖控制，但即使控制血糖也不能阻止延緩血管病變發(fā)生及進(jìn)程，說明DM患者血管病變可能是多因素共同作用結(jié)果，而中醫(yī)藥具有多層面、多進(jìn)程、多靶點(diǎn)共同作用機(jī)體，改善整體機(jī)能的優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病屬于“消渴”癥[12]，《素問》云：“二陽結(jié)為消”，指出燥熱郁結(jié)，陰液虧損是發(fā)病的主要病機(jī)，臨床以多食、多飲、多尿、消瘦為基本癥狀，心臟血管病變屬于消渴癥常見主要并發(fā)癥，主要因?yàn)檫w延不愈、熱灼津虧而致氣虛血瘀，臟腑功能失調(diào)伴心悸氣短、胸痛頻發(fā)，應(yīng)以活血化瘀兼益氣滋陰治療。

益氣活血方由黃芪、白術(shù)、茯苓、葛根、丹參、川芎、甘草組成，其中黃芪[13]健脾益氣，生津通脈，擴(kuò)張血管、改善血流變、可雙向調(diào)節(jié)血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗心律失常；白術(shù)降燥除濕，降血糖、增強(qiáng)白細(xì)胞吞噬力、增強(qiáng)免疫力、抗凝血；茯苓除熱生津，能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞毒性、抗炎抗菌、清楚自由基、增強(qiáng)胰島素活性；葛根解熱止渴，抗心律失常、改善心肌缺血、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、改善血流變、降低膽固醇；丹參活血祛瘀，抑制纖維組織增生、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、抗氧化抗凝血、抗動(dòng)脈硬化、降糖降脂、擴(kuò)張血管；川芎行氣止痛，降糖降脂抗凝血、增加冠狀動(dòng)脈血流量、抑制血管收縮、改善心??；甘草調(diào)和諸藥，抗炎抗變態(tài)、增強(qiáng)免疫力；全方針對(duì)消渴、心痛之癥，以益氣活血治本、通絡(luò)祛瘀治標(biāo)，標(biāo)本兼治，緩解改善諸多癥候。辛伐他汀[14]作為口服降血脂藥物，屬于羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑，可抑制肝臟制造膽固醇，有效避免血脂升高、降低心臟病發(fā)作幾率，常見副作用包括便秘、頭痛、惡心等。

本研究中，采用STZ破壞大鼠胰島β細(xì)胞，誘發(fā)大鼠糖尿病后以辛伐他汀及辛伐他汀聯(lián)合自擬活血益氣方給藥。各項(xiàng)指標(biāo)中，血糖長(zhǎng)期持續(xù)升高是導(dǎo)致糖尿病病變的主要原因之一，血糖升高致使糖基化末期產(chǎn)物生成，膠原合成，心肌及血管內(nèi)皮增生，生成大量自由基，損害機(jī)體組織和細(xì)胞。血脂作為動(dòng)脈粥樣硬化致病因素，有研究表明脂質(zhì)代謝異常會(huì)產(chǎn)生胰島素抵抗現(xiàn)象，其含量高低可作為檢測(cè)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(DC)指標(biāo)。糖尿病血管病變是一個(gè)慢性炎癥過程[15]，刺激內(nèi)皮細(xì)胞激活凝血系統(tǒng)，造成凝血功能紊亂，促進(jìn)白細(xì)胞黏附和附壁，加速動(dòng)脈粥樣硬化，促使炎癥進(jìn)一步發(fā)展，加重細(xì)胞組織損傷，hs-CRP作為炎癥過程標(biāo)志性因子，可有效反應(yīng)患者炎癥變化情況。ICAM-1[16]作為免疫球蛋白介導(dǎo)巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞黏附血管內(nèi)皮，引起血管內(nèi)皮損傷，血小板聚集，血管通透性增加致使動(dòng)脈血栓形成，加速動(dòng)脈粥樣硬化，與心臟血管損害程度呈正相關(guān)。MCP-1[17]作為趨化因子，具有吸附、趨化單核因子介導(dǎo)單核細(xì)胞活化，誘導(dǎo)黏附因子表達(dá)，促使炎癥細(xì)胞病變處聚集，而這正是動(dòng)脈粥樣硬化早期階段表現(xiàn)，其在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用。結(jié)果顯示，各組大鼠一般情況表現(xiàn)依次為模型組<西藥組<聯(lián)合組<對(duì)照組，說明益氣活血方顯著改善大鼠一般情況，提高生存質(zhì)量；模型組、西藥組、聯(lián)合組GLU均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)體質(zhì)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，聯(lián)合組GLU遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于模型組和西藥組(P<0.05)，聯(lián)合組體質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模型組和西藥組(P<0.05)，說明益氣活血方具有一定降糖、調(diào)節(jié)糖代謝、改善體質(zhì)量作用，對(duì)糖尿病機(jī)體改善更為顯著；通過血脂各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)比，可明顯發(fā)現(xiàn)辛伐他汀及辛伐他汀聯(lián)合自擬活血益氣方均能顯著改善TC、TG、HDL、LDL，其中TC、HDL兩者改善程度無明顯差異(P>0.05)，TG、LDL改善情況聯(lián)合組顯著優(yōu)于西藥組(P<0.05)，說明聯(lián)合治療對(duì)于DM血脂改善效果更好；模型組hs-CRP水平顯著高于西藥組、聯(lián)合組及對(duì)照組(P<0.05)，西藥組、聯(lián)合組及對(duì)照組之間hs-CRP水平無顯著差異(P>0.05)，說明西藥組、聯(lián)合組均能顯著降低炎癥反應(yīng)，效果相差不大；模型組、西藥組、聯(lián)合組ICAM-1及MCP-1表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，聯(lián)合組ICAM-1及MCP-1表達(dá)顯著低于模型組、西藥組(P<0.05)，說明聯(lián)合組更顯著抑制ICAM-1及MCP-1表達(dá)，抑制DM血管病變進(jìn)程，保護(hù)心臟血管。

綜上，益氣活血方可通過降糖降脂抗炎、抑制ICAM-1及MCP-1表達(dá)從而對(duì)心臟血管進(jìn)行保護(hù)。