復(fù)方中藥對感染森林腦炎病毒小鼠血液炎性因子的影響及相關(guān)性分析

張瑜

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

森林腦炎是由森林腦炎病毒所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性傳染病，當(dāng)致病力很強(qiáng)或大量的森林腦炎病毒侵入機(jī)體并通過血腦屏障侵入腦組織時(shí)，就會(huì)引發(fā)腦內(nèi)的固有免疫細(xì)胞，特別是小膠質(zhì)細(xì)胞激活而發(fā)生強(qiáng)烈的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，小膠質(zhì)細(xì)胞激活后會(huì)通過釋放大量具有神經(jīng)毒性的炎癥因子，如腫瘤壞死因子、白介素、前列腺素、一氧化氮等造成神經(jīng)損傷，即免疫介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)引起的腦組織繼發(fā)性損害，對腦組織造成更大的傷害[1-3]。目前，森林腦炎的治療藥物主要有地塞米松、利巴韋林和干擾素等，這些藥物雖都有抗菌消炎的作用，但如果長期、大劑量應(yīng)用，則會(huì)引起各種不良反應(yīng)和停藥反應(yīng)[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)依據(jù)我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)臨床經(jīng)驗(yàn)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究成果，以具有抗病原微生物、抗炎、抗過敏的苦參為主藥，輔以具有鎮(zhèn)痛、保護(hù)神經(jīng)和調(diào)節(jié)免疫功能的訶子、川楝子、梔子、紫花地丁對感染森林腦炎病毒的小鼠進(jìn)行治療，對其血清中炎性因子的含量進(jìn)行測定，并對炎性因子與上游蛋白的相關(guān)性進(jìn)行分析，以期為復(fù)方中藥森林腦炎的治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 病毒液的制作和收集

將森林腦炎病毒液加入地鼠腎傳代細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入病毒液后慢慢晃動(dòng)混勻，保證病毒液充分接觸并感染細(xì)胞后，培養(yǎng)瓶37 ℃培養(yǎng)90 min。每天觀察細(xì)胞，當(dāng)超過90%細(xì)胞病變并有細(xì)胞脫落時(shí)收獲細(xì)胞病毒液，然后反復(fù)在-80℃、-37℃條件下反復(fù)凍融細(xì)胞，充分釋放病毒于細(xì)胞培養(yǎng)液中，無菌條件下1 000 rpm，離心10 min，收集上清液，分裝備用。

1.1.2 感染小鼠模型的制作

選取清潔級21日齡雄性小鼠，體質(zhì)量(18±1)g，制作模型前禁食12 h，禁水6 h。將小鼠麻醉后，在小鼠眼后角、耳前緣、顱中線所構(gòu)成的三角形中點(diǎn)部位，將微量注射器抽取好的病毒懸液20 μL垂直進(jìn)針3～5 mm，將病毒液緩慢推進(jìn)鼠腦，注毒結(jié)束后待病毒液完全吸收后再快速將針頭拔出，以免未被腦組織完全吸收的病毒液流出。采用RT-PCR技術(shù)檢測實(shí)驗(yàn)小鼠血清中森林腦炎病毒的RNA片段，以鑒定動(dòng)物模型制作的成功。

1.1.3 復(fù)合中藥

苦參、訶子、川楝子、梔子和紫花地丁5味藥材飲片由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)提供，經(jīng)50℃烘干、粉碎后過40目篩制成原粉?？鄥?、訶子、川楝子、梔子和紫花地丁原粉按4∶2∶2∶2∶1的比例組方，加水煎煮2次，每次煎煮90 min，取過濾后藥汁混合，濃縮使1 mL的藥液相當(dāng)于1 g的藥粉，制成實(shí)驗(yàn)藥液。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組

選取12只健康小鼠作為空白組，另選取60只模型小鼠隨機(jī)分為模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組和陽性藥(地塞米松)組，每組12只。各組具體處理方法見表1。

動(dòng)物飼養(yǎng)于人工控制條件下，小鼠同室、分籠飼養(yǎng)，每籠6只。室溫控制在20℃～23℃，相對濕度為50%～60%，每12 h光照/黑暗循環(huán)，小鼠可自由進(jìn)食、進(jìn)水，保持墊料清潔干燥，實(shí)驗(yàn)期為7天。

表1 各組大鼠處理情況

1.3 檢測指標(biāo)與方法

1.3.1 樣本采集

在實(shí)驗(yàn)第4天和7天，每組選擇5只小鼠麻醉后，用毛細(xì)管于眼球后靜脈叢采集血液1 mL于內(nèi)壁涂有肝素的離心管中，并將標(biāo)本在采集后的30 min內(nèi)于4 ℃條件下3 000 rpm離心15 min后取上清液，置于-80℃低溫冰箱保存，以檢測血清中相應(yīng)的指標(biāo)。

1.3.2 檢測指標(biāo)與方法

實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組小鼠第4天、7天腦組織和血清中TLR-2、IL-1β、IL-6、TNF-α含量，試劑盒均購自上海聯(lián)邁生物工程公司，實(shí)驗(yàn)方法按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，組間數(shù)據(jù)比較采用one-way ANOVA單因素方差分析，以P≤0.05表示差異顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 小鼠血清中炎性因子的分析

小鼠血液中炎性因子的檢測結(jié)果見表2。在實(shí)驗(yàn)第4天和7天，模型組和各治療組小鼠血清中的TLR-2水平顯著高于空白組(P<0.05)；在實(shí)驗(yàn)第4天和7天，模型組、陽性藥組、低劑量組小鼠血清中的TLR-2濃度顯著高于中、高劑量組(P<0.05)。

在實(shí)驗(yàn)第4天和7天，模型組和各治療組小鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α濃度顯著高于空白組(P<0.05)；在實(shí)驗(yàn)第4天和7天，模型組、低劑量組小鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α濃度顯著高于陽性藥組和中、高劑量組(P<0.05)。

表2 復(fù)方中藥對各組小鼠血清中炎性因子含量的影響

注：與空白組比較,*P<0.05;與中劑量組比較,△P<0.05;與高劑量組比較,#P<0.05;與陽性藥組比較,▲P<0.05。

2.2 小鼠血清中各炎性因子相關(guān)性分析

2.2.1 小鼠血清中IL-1β與TLR-2相關(guān)性分析

小鼠血清中IL-1β與TLR-2相關(guān)性結(jié)果分析見圖1。如圖1所示，實(shí)驗(yàn)第4天，IL-1β與TLR-2相關(guān)性的回歸方程式為Y=0.354X-2.950，r=0.962，二者正相關(guān)；實(shí)驗(yàn)第7天，IL-1β與TLR-2相關(guān)性的回歸方程式為Y=0.239X+1.163，r=0.848，二者正相關(guān)。結(jié)果見圖1。

圖1 小鼠血清中IL-1β與TLR-2相關(guān)性分析

2.2.2 小鼠血清中IL-6與TLR-2相關(guān)性分析

小鼠血清中IL-6與TLR-2相關(guān)性分析結(jié)果見圖2。如圖2所示，實(shí)驗(yàn)第4天，IL-6與TLR-2相關(guān)性回歸方程式為Y=0.954X-0.929，r=0.965，二者正相關(guān)；實(shí)驗(yàn)第7天，IL-6與TLR-2相關(guān)性回歸方程式為Y=0.683X+9.021，r=0.874，二者正相關(guān)。結(jié)果見圖2。

2.2.3 小鼠血清中TNF-α與TLR-2相關(guān)性分析

小鼠血清中TNF-α與TLR-2相關(guān)性分析結(jié)果見圖3。如圖3所示，實(shí)驗(yàn)第4天，TNF-α與TLR-2相關(guān)性回歸方程式為Y=3.398X-28.620，r=0.962，二者正相關(guān)；實(shí)驗(yàn)第7天，TNF-α與TLR-2相關(guān)性回歸方程式：Y=2.122X+15.350，r=0.875，二者正相關(guān)。結(jié)果見圖3。

圖2 小鼠血清中IL-6與TLR-2相關(guān)性分析

圖3 小鼠血清中TNF-α與TLR-2相關(guān)性分析

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所采用的組方以苦參為君藥，其主效成分苦參堿具有抵抗多種病原微生物的作用，而且對炎癥也有明顯的抑制作用。梔子中的苷類和酸類物質(zhì)具有消炎作用，訶子具有抗氧化的作用，而川楝子和紫花地丁具有抗菌作用。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，該5味中藥組方具有抗菌、消炎、清熱、涼血之功效。

免疫反應(yīng)是動(dòng)物機(jī)體的一種自我保護(hù)的行為，是抵抗外源性的致病因子的感染和侵襲，是用來排除異己的自我防護(hù)機(jī)制[5]。免疫反應(yīng)分特異性免疫反應(yīng)和非特異性免疫反應(yīng)，通常來說，抗原-抗體的反應(yīng)體系均為特異性的免疫反應(yīng)，這主要包括B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的參與；而其他種類如巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞，則主要介導(dǎo)非異性免疫應(yīng)答。特異性免疫反應(yīng)和非特異性免疫反應(yīng)是構(gòu)成機(jī)體天然的防御體系之一[6]。一般情況下，人體在受到的感染比較輕微時(shí)，機(jī)體自身適度的免疫反應(yīng)確實(shí)能夠幫助清除入侵到體內(nèi)的病原體，這種情況下并不會(huì)發(fā)生典型的免疫反應(yīng)，反而對機(jī)體正常組織的保護(hù)是有利的。但是，當(dāng)病原體的致病力較強(qiáng)或?qū)w內(nèi)的侵襲規(guī)模過大時(shí)，機(jī)體便會(huì)調(diào)動(dòng)更多的免疫反應(yīng)防御體系對 “入侵”予以“反抗”，這種情況下就極其容易發(fā)生過度的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致與免疫相關(guān)的炎癥因子、趨化因子和活化的免疫細(xì)胞大量聚集到機(jī)體的被感染區(qū)，共同“抵抗”外源病原體的入侵，這種“反抗”的升級不僅不會(huì)保護(hù)體的正常組織，反而會(huì)造成感染區(qū)的器官組織遭受更大的破壞，對機(jī)體自身產(chǎn)生傷害，這就是局部的炎癥反應(yīng)[7]。因此，在臨床研究時(shí)，也可以通過測定這些比較常見的炎性因子來判斷機(jī)體是否出現(xiàn)了過度的局部炎癥反應(yīng)。

研究表明，IL-1β、IL-6 和TNF-α是比較常見的炎性因子。IL-1β存在于腦內(nèi)的廣泛區(qū)域，通常情況下，IL-1β在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)比較低，而當(dāng)機(jī)體整體或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的局部發(fā)生損傷和感染時(shí)，會(huì)出現(xiàn)IL-1β的表達(dá)顯著提高。而IL-6是趨化因子家族的一類細(xì)胞因子，在腦中會(huì)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)和毒性的雙重作用。在正常的腦組織中，IL-6表達(dá)水平較低，這種情況下，IL-6對腦的中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有營養(yǎng)、修復(fù)和免疫介導(dǎo)等正向生理作用，而當(dāng)腦組織遭到過量的病原體入侵或發(fā)生損傷時(shí)，IL-6則會(huì)過度表達(dá)，而過高水平的IL-6則會(huì)參與甚至加重腦組織的神經(jīng)損傷。對病毒性腦炎幼兒的研究表明，在腦炎的早期和恢復(fù)期，腦脊液、血漿中的IL-1β、IL-6的含量顯著高于對照組，且二者呈正相關(guān)，這就證明了IL-1β、IL-6兩種因子共同參和介導(dǎo)了腦組織急性免疫導(dǎo)致的炎癥損傷，進(jìn)一步加重了腦組織受到的損害[8]。TNF-α則是一種可溶性的多肽，而入侵到體內(nèi)的病毒、細(xì)菌、寄生蟲等則是刺激機(jī)體產(chǎn)生TNF-α的主要因素。TNF-α在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，主要由腦中的神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞合成。TNF-α在參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)和對腦組織繼發(fā)性損傷方面起到了至關(guān)重要的作用，與其他炎性因子一樣，體內(nèi)適當(dāng)?shù)腡NF-α濃度對腦組織確實(shí)可以起到有益的保護(hù)作用，但過度的TNF-α表達(dá)則會(huì)加重腦損傷導(dǎo)致其神經(jīng)細(xì)胞的變性、壞死。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α主要以三種方式對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響:一是神經(jīng)外周的TNF-α通過神經(jīng)介質(zhì)作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)或透過受損的血腦屏障進(jìn)入腦的中樞神經(jīng)系統(tǒng)；二是外周細(xì)胞直接進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，再產(chǎn)生TNF-α；三是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)活化的免疫細(xì)胞及神經(jīng)元等分泌、合成并發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。有學(xué)者認(rèn)為，TNF-α是其他炎性反應(yīng)因子的始動(dòng)因子，可以直接促進(jìn)中性粒細(xì)胞向感染區(qū)組織聚集，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞釋放IL-6、IL-1等一系列炎性因子[9]。研究還表明，TNF-α?xí)又馗腥静《拘阅X炎后，腦組織的炎癥反應(yīng)和并加重腦組織的損傷，TNF-α可以通過刺激機(jī)體產(chǎn)生急相蛋白，誘導(dǎo)內(nèi)皮黏附分子的表達(dá)，并誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌其他的炎性介質(zhì)[10]。

研究表明，機(jī)體在受到病原體入侵時(shí)產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)與Toll受體家族參與的細(xì)胞通路密切相關(guān)。TLR-2是Toll受體家族的成員之一，主要存在于細(xì)胞膜上，是參與機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)的重要蛋白質(zhì)分子，同時(shí)也是動(dòng)物體內(nèi)連接特異性免疫和非特異性免疫的橋梁。研究表明，TLR-2的過度表達(dá)會(huì)對宿主的抗病毒反應(yīng)造成不利影響，進(jìn)而加劇腦組織的炎癥損傷。研究還表明，活化的TLR-2會(huì)誘導(dǎo)TNF-α過度表達(dá)，從而導(dǎo)致致小鼠的血腦屏障通的透性提高，導(dǎo)致病毒更容易進(jìn)入腦組織。已有研究表明，TLR-2在識別配體后可以進(jìn)一步促進(jìn)了IL-1、IL-6及TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生[11]。有報(bào)道指出，病毒表面的血凝集素多糖會(huì)刺激機(jī)體內(nèi)TLR-2的過度表達(dá)。而森林腦炎病毒的研究指出，在病毒的表面也有血凝集素多糖的大量存在，因此在本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠的血液中的TLR-2水平顯著高于對照組，這也與前人的理論研究結(jié)果相一致。有報(bào)道指出，苦參堿能夠抑制大鼠內(nèi)臟TNF和IL-6的分泌。還有研究指出，飼喂給患有關(guān)節(jié)炎的小鼠灌注含有訶子提取物的藥液可有效降低小鼠血清中IL-1β的濃度。本實(shí)驗(yàn)中，中、高劑量的復(fù)方中藥可顯著降低感染森林腦炎小鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α的含量，這也與前人的研究成果相似，而低劑量組無明顯效果可能也與活性成分較少，說明本實(shí)驗(yàn)中，藥物濃度過低無法對感染森林腦炎病毒小鼠的炎癥反應(yīng)起到有效的調(diào)控作用。在本實(shí)驗(yàn)中，與對檢測TLR-2的結(jié)果不同，陽性藥組對感染森林腦炎小鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α的含量有降低作用。這說明復(fù)方中藥與地塞米松調(diào)控感染森林腦炎小鼠驗(yàn)證反應(yīng)的機(jī)制并不相同。在本實(shí)驗(yàn)中，中、高劑量的復(fù)方中藥可以顯著降低感染森林腦炎小鼠血清中TLR-2的濃度。這可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)所用復(fù)方中藥包括了梔子和紫丁地花，研究表明，梔子和紫丁地花的活性成分能抑制兔巨噬細(xì)胞中Toll家族蛋白的表達(dá)，從而下調(diào)TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá)，降低兔的炎性反應(yīng)。而低劑量和陽性藥組感染森林腦炎小鼠血清中TLR-2的濃度并無顯著變化，造成這種情況的原因可能并不相同。低劑量的復(fù)方中藥對TLR-2的抑制作用較不明顯，可能是因?yàn)橹兴幹械幕钚猿煞州^少，無法起到有效的生物學(xué)作用。而有研究表明，地塞米松對小鼠TLR-2的表達(dá)無顯著影響，而是對同樣是Toll受體家族的成員的TLR-4有調(diào)控作用，從而對免疫系統(tǒng)的炎性反應(yīng)起調(diào)控作用。這說明，在本實(shí)驗(yàn)中，中藥對炎癥反應(yīng)的調(diào)控是通過TLR-2途徑來完成的，而陽性要組則可能是通過TLR-4途徑來完成的。

本實(shí)驗(yàn)相關(guān)分析結(jié)果顯示，除陽性藥組外，其他各組小鼠血清中TLR-2與IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)均呈高度正相關(guān)，說明TLR-2介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最終會(huì)促使IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌量增加，之間的相互協(xié)同作用參與了腦組織的炎性反應(yīng)，而應(yīng)用復(fù)方中藥可以抑制TLR-2的過度表達(dá)，減少炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的產(chǎn)生，減輕炎性反應(yīng)和小鼠腦組織損傷從而起到腦保護(hù)的作用。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)復(fù)方中藥所包含的苦參、訶子、川楝子、梔子和紫花地丁均具有降低動(dòng)物體炎性反應(yīng)的作用，通過對感染森林腦炎小鼠血清中TLR-2信號通路的最上游蛋白TLR-2和該通路的最下游產(chǎn)物IL-1β、IL-6、TNF-α的含量進(jìn)行了檢測及相關(guān)性分析表明。本實(shí)驗(yàn)復(fù)方中藥主要是通過抑制TLR-2的表達(dá)來下調(diào)感染森林腦炎小鼠的炎癥反應(yīng)的，為下一步通路水平的研究提供了依據(jù)。