重組人白介素35質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

顧香 陳吉泉 李兵

【摘要】 目的：通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組人白介素35（IL-35）質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究人IL-35的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。方法：用KG-1細(xì)胞（人白血病細(xì)胞）擴(kuò)增p35和EBI3的cDNA，將兩者先后連接至pSectag2A質(zhì)粒中，最后把Linker連接至pSectag2A-p35-EBI3中，構(gòu)建成pSectag2A-IL-35質(zhì)粒。結(jié)果：經(jīng)測(cè)序等方法鑒定重組質(zhì)粒中p35和EBI3序列與Genbank中（p35 NM-000882和EBI3 NM-005725）公布的序列一致。結(jié)論：成功構(gòu)建pSectag2A-IL-35真核表達(dá)載體。

【關(guān)鍵詞】 重組; PCR; IL-35; 質(zhì)粒

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.17.078 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2019）17-0-03

【Abstract】 Objective：To construct recombinant human IL-35 expression vector by molecular biology technique，which could lay a foundation for further study of the biological function of IL-35.Method：EBI3 and p35 were amplified by PCR from the cDNA library derived from the KG-1 cells.And they were cloned into pSectag2A vector.Finally Linker was cloned into pSectag2A-EBI3-p35，and pSectag2A-IL-35 plasmid was successfully reconstructed.Result：The pSectag2A-IL-35 vector was verified by DNA sequencing，whose sequencing were consistent with those published in Genbank（EBI3 nm-005725，p35 nm-000882）.Conclusion：Psectag2a-IL-35 eukaryotic expression vector is successfully constructed.

【Key words】 Recombinant; PCR; IL-35; Plasmid

First-authors address：Shanghai Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China

IL-35是白介素12家族的一員，1997年Devergne等[1]報(bào)道了IL-35是由白介素12的p35亞基（IL-12 p35，即p35）和EB病毒誘導(dǎo)基因3（EBI3）構(gòu)成。p35及EBI3基因編碼分子量分別為35、34 kD的糖蛋白[2]。2007年Collison等[3]經(jīng)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）可高表達(dá)EBI3和p35，且兩者的二聚體能加強(qiáng)Tregs的免疫抑制功效。2007第13屆免疫學(xué)國(guó)際會(huì)議上，由Vignali首次提議該二聚體命名為IL-35，最后成功獲批。自此，IL-35就成為免疫學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建人IL-35質(zhì)粒，為深入研究IL-35的生物學(xué)作用及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒 人白血病細(xì)胞株KG-1由華東理工大學(xué)代同成博士惠贈(zèng)，pSectag2A載體由英國(guó)格拉斯哥大學(xué)Wei Xiaoqing教授惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶HindⅢ、EcoRⅠ、NotⅠ、XhoⅠ，DL2000 Marker、T4DNA連接酶、質(zhì)粒抽提試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）、T載體（TAKARA）、DNA膠回收試劑盒、RNA提取試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基 DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自GIBICO公司，Hyclone胎牛血清。

1.2 方法

1.2.1 p35和EBI3 cDNA的克隆 按照p35和EBI3在NCBI的GenBank中的cDNA序列，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物。依照pSectag2A質(zhì)粒圖譜，篩選酶切位點(diǎn)。在EBI3上游引物的5端加上4個(gè)保護(hù)堿基并引入HindⅢ酶切位點(diǎn)：AAAGAAGCTTTGCCCGCCCTGCAGTGGA，EBI3下游引物的5端加上5個(gè)保護(hù)堿基并引入EcoRⅠ及NotⅠ酶切位點(diǎn)：ATTAAGAATTCGCGGCCGCGCCCAGGCTCATTGTGG;在p35上游引物的5端加上10個(gè)保護(hù)堿基并引入NotⅠ酶切位點(diǎn)：ATATTAGAATGCGGCCGCAACCTCCCCGTGGCCAC，p35下游引物的5端加上4個(gè)保護(hù)堿基并引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)：GGCCCTCGAGGGAAGCATTCAGATAGCTCAT;Linker引物均引入NotⅠ酶切位點(diǎn)，HLS：GGCCGCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGC，HLA：GGCCGCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCGC。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 KG-1細(xì)胞RNA的提取及PCR擴(kuò)增目的片段 用PBS沖洗細(xì)胞2遍，按每106個(gè)細(xì)胞加入1 ml的Trizol，將細(xì)胞輕輕沖洗下來(lái)，收集至1.5 ml離心管中，隨后加入200 μl氯仿，經(jīng)過(guò)劇烈震蕩，4 ℃，13 000 r/min離心15 min，可分3層，上層為RNA水相，將其吸出并加入500 μl異丙醇，冰上靜置10 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，棄上清，加入1 ml預(yù)冷的用DEPC水配制的75%乙醇，混勻后4 ℃，12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入30 μl的焦碳酸二乙酯水溶解。

把上述RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA文庫(kù)，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)的反應(yīng)體系：5×PrimeScript RT Master Mix 2 μl，Total RNA 7 μl，RNase Free 1 μl;反應(yīng)參數(shù)：37 ℃ 30 min;85 ℃ 5 s，4 ℃ 10 min。

以上述引物為引物，將逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物EBI3、p35去掉信號(hào)肽序列、起始及終止密碼子，大小為642 bp及591 bp。

1.2.3 IL-35-pSectag2A重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相回收目的片段。將膠回收的產(chǎn)物EBI3及p35連接到T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆于3 ml LB培養(yǎng)基中，37 ℃，120 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒，對(duì)EBI3利用HindⅢ、EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，用T4連接酶將酶切的目的片段和同樣酶切的pSectag2A載體片段分別進(jìn)行黏性末端的連接，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定后測(cè)序。

測(cè)序正確后，將p35經(jīng)NotⅠ、XhoⅠ雙酶切，用T4連接酶將酶切的目的片段和同樣酶切的pSectag2A-EBI3載體片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定后測(cè)序。

若測(cè)序正確，以退火反應(yīng)獲得Linker。退火體系：LinkerS：5 μl，LinkerA：5 μl，Buffer：10 μl，ddH2O：80 μl。退火參數(shù)：90 ℃ 5 min，37 ℃ 1 h。在退火產(chǎn)物中加入100 μl ddH2O，并加入600 μl無(wú)水乙醇，混勻后放入-20 ℃冰箱過(guò)夜，12 000 r/min，離心5 min，棄上清，待酒精揮發(fā)完后加入20 μl ddH2O，混勻后與經(jīng)NotⅠ單酶切的pSectag2A-EBI3-p35載體連接，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定后測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 p35和EBI3基因的克隆

通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增獲得p35、EBI3基因片段，RT-PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳后可見(jiàn)大小約為591 bp及642 bp的條帶，所獲條帶與預(yù)期大小相符（圖1），可將其連接至pUCm-T載體。

2.2 pUCm-T-EBI3、pUCm-T-p35的酶切產(chǎn)物

RT-PCR產(chǎn)物EBI3與pUCm-T連接，同時(shí)與pSectag2A經(jīng)HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切;p35與pUCm-T連接，并與pSectag2A-BBI3經(jīng)NotⅠ、XhoⅠ雙酶切。上述酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2中1泳道為DL 2000 DNA Marker，2泳道顯示大小兩條帶，其中小片段大小與預(yù)期大小相符（591 bp）;3泳道所顯示條帶的大小與預(yù)期大小相符（5 707 bp）;4泳道為10 000 bp DNA Marker，5泳道顯示一條帶，其大小與理論值（6 349 bp）一致，6泳道顯示大小兩條帶，其中小片段大小與預(yù)期大小相符（642 bp），最后將目的片段p35和EBI3切膠回收，分別與pSectag2A及pSectag2A-EBI3連接。

退火獲得Linker產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3中2泳道顯示一條帶，大小與理論值（51 bp）相符，未見(jiàn)其他非特異性條帶。

EBI3及p35片段先后連接至pSectag2A構(gòu)成重組質(zhì)粒pSectag2A-EBI3-p35，經(jīng)過(guò)NotⅠ單酶切的產(chǎn)物，隨后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示。圖3中4泳道顯示的條帶為線性化的pSectag2A-EBI3-p35載體，大小與理論值（6 349 bp）相符，切膠回收目的條帶，最后與Linker連接。

2.3 重組IL-35-pSectag2A真核表達(dá)載體的鑒定。

以HES、HEA為引物PCR鑒定重組載體pSectag2A-EBI3，結(jié)果示圖4中2、4、5泳道顯示一條帶，大小與理論值（642 bp）一致，表明pSectag2A與目的片段EBI3連接成功。用測(cè)序引物T7/BGH對(duì)pSectag2A質(zhì)粒進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI中GenBank上的序列（p35 NM-000882，EBI3 NM-005725）完全一致。

3 討論

1997年，EBI3-p35由Devergne首次發(fā)現(xiàn)[1]，在2007年正式被命名為IL-35，后者是IL-12家族的一員，屬于I型細(xì)胞因子超家族成員，由α鏈p35和β鏈EBI3組成[4-5]。IL-35主要由Treg、調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（Breg）細(xì)胞分泌[3]。在Treg表面，IL-35的信號(hào)通路由信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因（STAT）STAT1-STAT4，STAT4-STAT4，STAT1-STAT1介導(dǎo)[6];而在Breg表面，則由STAT1-STAT3介導(dǎo)[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，IL-35是具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子[8]，通過(guò)增強(qiáng)Treg細(xì)胞的功能，抑制Th17細(xì)胞的增殖分化，發(fā)揮免疫抑制功能，抑制炎癥反應(yīng)、防止過(guò)度的自身免疫反應(yīng)的發(fā)生[9]。由此可見(jiàn)，IL-35在諸多疾病中，均具有不容小覷的作用。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了pSectag2A-IL-35真核表達(dá)載體，為體內(nèi)外進(jìn)一步研究IL-35的功能和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-01-08） （本文編輯：何玉勤）