高遷移率族蛋白1在骨肉瘤的表達及意義

鐘志輝　白國昌

[摘要] 目的 探討高遷移率族蛋白1（HMGB1）在骨肉瘤組織的表達情況及其與臨床病理因素之間的關系，并探討可能機制。 方法 方便選取2012年1月—2016年12月53例確診為原發(fā)性骨肉瘤患者作為實驗組，同期確診為骨軟骨瘤30例患者作為對照組，采用免疫組化檢測HMGB1蛋白的表達情況。在實驗組分析HMGB1的表達與臨床病理因素之間的關系，并探討其與Ki-67的表達關系。 結果 骨肉瘤組織中HMGB1蛋白表達于細胞核和細胞質(zhì)中，有54.7%病例為高表達，其比率高于骨軟骨瘤病例（23.3%），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.006）。HMGB1的高表達與較高級的Enneking分期（P=0.011）和遠處轉移（P=0.003）有關。相比之下，HMGB1的表達與其他臨床因素（包括性別、年齡、解剖位置、原發(fā)腫瘤大小和組織學類型）之間沒有顯著相關性（P>0.05）。并且HMGB1蛋白的表達與Ki-67蛋白表達之間呈正相關關系（γ=0.632，P<0.05）。 結論 HMGB1在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，有望成為骨肉瘤診斷及治療的分子靶點。

[關鍵詞] 骨肉瘤;HMGB1; Ki-67;免疫組化

[中圖分類號] R684? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2019）05（a）-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of high mobility group protein 1 （HMGB1） in osteosarcoma and its relationship with clinicopathological factors and possible mechanism. Methods From January 2012 to December 2016， a total of 53 patients with primary osteosarcoma were convenient selected as the experimental group while 30 patients with osteochondroma were selected as the control group. The expression of HMGB1 protein was detected by immunohistochemistry. In the experimental group， the relationship between HMGB1 expression and clinicopathological factors was analyzed. Moreover， the relationship between HMGB1 expression and Ki-67 expression was also explored. Results Expression of HMGB1 protein was detected both in the nucleus and cytoplasm of osteosarcoma cell. The expression of HMGB1 in osteosarcoma was higher than that in osteochondroma （54.7% vs 23.3%， P=0.006）. The high expression of HMGB1 was associated with the high Enneking stage （P=0.011） and distant metastasis （P=0.003）. In contrast， there was no significant correlation between HMGB1 expression and other clinicopathological factors， including gender， age， anatomical location， size of primary tumors and histological type （P>0.05）. The expression of HMGB1 protein was positively correlated with the expression of Ki-67 protein （γ= 0.632， P<0.05）. Conclusion HMGB1 plays an important role in the occurrence and development of osteosarcoma and is expected to become a molecular target for diagnosis and treatment of osteosarcoma.

[Key words] Osteosarcoma; HMGB1; Ki-67; Immunohistochemistry

骨肉瘤作為最常見的惡性、原發(fā)性骨腫瘤之一，是兒童和青少年癌癥相關死亡的第二原因[1]。它被認為是起源于與骨形成相關的原始間充質(zhì)細胞，通常位于長骨干骺端，尤其是脛骨近端和股骨遠端[2]。盡管新輔助化療和手術切除技術有了很大改進，骨肉瘤的總生存率在過去幾十年中沒有顯著變化。更糟的是，有局部復發(fā)和遠處轉移患者的5年生存率低于30%[3]。雖然一些基因的突變被認為與骨肉瘤有關，但其發(fā)病的分子機制仍不清楚[4]。因此，尋找新的診斷和預后標志物，尋找潛在的治療靶點，對提高骨肉瘤患者的預后具有重要意義。

高遷移率族蛋白-l （High-mobility group protein B1，HMGB1） 是一種廣泛存在于真核生物的非組蛋白染色體結合蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中具有很高的遷移率而得名[5]。新近研究發(fā)現(xiàn)HMGBl在多種類型腫瘤的表達水平均顯著高于相應的正常組織，如乳腺癌、前列腺癌、胃腸道腺癌、肝細胞癌、結直腸癌、宮頸癌等，且大多與臨床預后相關[6-8]。但HMGB1與骨肉瘤的關系相關研究仍鮮有報道。因此，該研究方便選取2012年1月—2016年12月53例原發(fā)性骨肉瘤患者，檢測骨肉瘤組織中HMGB1的表達，并探討HMGB1的表達與臨床病理因素的關系及可能的機制，現(xiàn)報道如下。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

方便選取福建醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院和漳州市醫(yī)院骨科53例原發(fā)性骨肉瘤患者。所有骨肉瘤均未經(jīng)任何處理收集。將初始活檢組織標本凍存于液氮中直至使用。在確診后，所有患者根據(jù)Enneking分期系統(tǒng)進行術前新輔助化療和手術切除[9]。出院后定期隨訪。從醫(yī)院病歷中獲取腫瘤部位、局部、遠處狀態(tài)和總生存率等相關臨床資料。選取同期確診為骨軟骨瘤30例患者作為對照。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，且所有入選患者均簽署知情同意書。

1.2? 主要實驗試劑

HMGB1單克隆抗體、Ki67 單克隆抗體抗體購自美國Abcam公司。抗原修復液、PV-9000試劑及二氨基聯(lián)苯（DAB）顯色試劑盒等購自福州邁新生物技術有限公司。

1.3? 免疫組化方法

骨肉瘤及骨軟骨瘤組織以蠟塊形式儲存，實驗時取出，切成4μm厚切片貼附于載玻片，置60℃烤箱中過夜。依次置于二甲苯、無水酒精中、95%酒精中、80%酒精、70%酒精中進行脫蠟和再水合。使用檸檬酸鹽緩沖液（10 mM，pH 6）在微波爐中進行熱誘導抗原回收。使用正常山羊血清抑制內(nèi)源性過氧化物酶的活性，再將載玻片與3%過氧化氫溶液在甲醇中孵育。隨即在切片上加入抗HMGB1（Abcam，美國）或Ki-67（Abcam，美國）小鼠單克隆抗體，在4℃孵育過夜。然后用過氧化物酶抗小鼠血清免疫球蛋白G（ZSGB-BIO，中國）孵育切片。洗滌后，用DAB顯色試劑盒檢測HMGB1。再用蘇木精對細胞核進行復染色。最后，在一系列的酒精稀釋和二甲苯中脫水切片。

1.4? 觀察指標

為了評價目標蛋白的染色結果，每張切片均由2名病理科醫(yī)生獨立雙盲觀察。隨機選取具有代表性的10個高倍視野，每個視野計數(shù)約200個細胞。根據(jù)染色細胞百分率和染色強度進行評分。染色細胞百分率分級評分：染色細胞<5%為0分， 6%～25%為1分，26%～ 50%為2分，>51%為3分;染色強度分級評分：基本不著色為0分，淺著色為1分，適中著色為2分，深著色為3分。將每張切片染色細胞百分率得分與染色強度得分相加為最終得分：0～3分為低表達，超過3分為高表達。

1.5? 統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）來表示，計量資料比較用t檢驗，計數(shù)資料[n（%）]用χ2檢驗，兩種蛋白表達的相關性采用Spearman 相關分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

2.1? HMGB1在骨肉瘤及骨軟骨瘤組織中的表達

為評估HMGB1在骨肉瘤中的表達，對53例骨肉瘤組織進行免疫組織化學染色。結果顯示骨肉瘤組有29個樣本（54.7%）中檢測到HMGB1高表達，細胞核及細胞質(zhì)中均可見。而在骨軟骨瘤組30個樣本僅有7樣本（23.3%）檢測到HMGB1高表達，兩者差異有統(tǒng)計學意義，見表1。

2.2? HMGB1表達與骨肉瘤臨床病理因素的關系

為探討HMGB1表達與骨肉瘤臨床病理特征的關系，將53例原發(fā)性骨肉瘤患者分為兩組。結果顯示HMGB1的高表達與較高級的Enneking分期（P=0.011）、和遠處轉移有關（P=0.003）。相比之下，HMGB1的表達與其他臨床因素（包括性別、年齡、解剖位置、原發(fā)腫瘤大小和組織學類型）之間沒有顯著相關性，見表2。

2.3? HMGB1表達與Ki-67的相關性

HMGB1 蛋白高表達的病例中， Ki-67蛋白高表達率為75.9% （22/29）， HMGB1 低表達的病例中， Ki-67的高表達率為12.5% （3/24）。結果表明HMGB1蛋白的表達與Ki-67蛋白表達之間呈正相關關系（γ=0.632，P=0.002），見表3。

3? 討論

骨肉瘤是嚴重威脅青少年健康的一種惡性腫瘤。盡管近年來新輔助化療和切除重建方面有了明顯的進展，但骨肉瘤總的生存率沒有實質(zhì)性的改變。因此，尋找能夠準確的診斷和預后的分子標志物，從而進行骨肉瘤的精準治療，以改善治療效果顯得尤為重要[10]。

該研究初步進行了HMGB1在骨肉瘤中的表達及與臨床病理特征的關系研究。免疫組化的結果表明，HMGB1蛋白在超過一半的骨肉瘤患者組織中高表達，而骨軟骨瘤這一良性骨病變組織中僅有23.3%的高表達率，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P=0.006）。He等人[11]研究也發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細胞HMGB1高表達率達51.7%，與該研究接近。這提示HMGB1可能是骨肉瘤診斷的重要分子。近年來，Wu等[12]發(fā)現(xiàn)90例肺癌組織HMGB1高表達例數(shù)為51例（56.7%），而在臨近正常組織中僅有30.0%高表達;Rrapaj等[13]發(fā)現(xiàn)HMGB1在惡性胸膜間皮瘤中也高表達。Kostova 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在食管癌和結腸癌等多種惡性腫瘤細胞中表達率增高，并且在中度分化的癌中HMGB1蛋白的定位是細胞核周圍的，而在低分化的癌中有非特異性核聚集的趨勢。這與該研究結果相近，即HMGB1蛋白可同時表達于細胞核和細胞質(zhì)中。大量研究表明HMGB1在許多惡性腫瘤組織中有不同程度的高表達提示HMGB1可能參與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展進程。

進一步行臨床病理因素與HMGB1相互關系研究，結果表明HMGB1表達增加與重要的臨床病理因素有關，包括Enneking分期（P=0.011）、和遠處轉移（P=0.003）。盡管這兩種因素通常與骨肉瘤較差的預后有關。但臨床病理因素是病人就診時不能改變的事實，其只能幫助判斷而不是改變預后。然而，HMGB1與不良的臨床病理因素相關，則提示其有可能成為潛在治療靶點，有助于開發(fā)新藥以改善骨肉瘤患者預后。盡管該研究提示HMGB1與原發(fā)骨肉瘤大小無關，但有研究提示HMGB1與腫瘤大小和核分級相關，并且HMGB1高表達直接導致骨肉瘤生存率下降[11]。這種差異一方面可能歸因于所采納的標準不一樣，有的研究以腫瘤直徑7 cm來分組，而該研究則以常用的5 cm來分組;另一方面可能是納入的病例數(shù)存在抽樣誤差。此外，有研究提示HMGB1卻可能是某些惡性腫瘤，如胰腺癌進展的抑制因素，因為HMGB1能抑制K-Ras基因驅動的腫瘤進程[15]。這表明HMGB1所發(fā)揮的作用可能與腫瘤類型相關。

HMGB1影響惡性腫瘤的進展機制目前尚未被完全闡明。Ki-67是一種細胞核蛋白，除靜止期以外的所有細胞周期中均有表達，故其被當做大多腫瘤組織細胞增殖活性的標記物。許多研究提示 Ki-67 的表達與骨肉瘤的惡性程度及預后等因素密切相關。該研究發(fā)現(xiàn)53例骨肉瘤患者中有25例Ki-67高表達，且其中22例一并有HMGB1高表達，兩者之間呈明顯的正相關，相關系數(shù)達0.632，提示HMGB1可能通過促進骨肉瘤細胞的增殖來促進腫瘤的進展，因此與不良的臨床病理因素關聯(lián)。有學者則認為HMGB1通過增加腫瘤相關的轉錄因子或增加血管形成來促進惡性腫瘤的進展[16];或者HMGB1通過促進上皮間質(zhì)轉化來促進前列腺癌的進展[8];也有研究表明HMGB1與乳腺癌細胞的干細胞特性相關[17]。該課題組前期實驗證實Ki-67與骨肉瘤干細胞標志物CD133表達正相關，而且兩者結合更能判定其預后[18]。那么HMGB1與骨肉瘤的干細胞特性是否相關值得進一步研究。此外，HMGB1影響骨肉瘤進展的其它機制仍尚不完全清楚，需要進一步研究。該研究還有其他局限性，如該研究屬于回顧性研究可能會導致信息收集的偏倚，樣本量不夠大。因此，將在未來進行更大規(guī)模和更具前瞻性的研究。

綜上所述，該研究初步表明HMGB1的高表達與骨肉瘤的侵襲性臨床病理特征相關。因此，HMGB1在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，有望成為骨肉瘤潛在的診斷與預后生物標志物，以及有前途的骨肉瘤分子治療靶點。

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（收稿日期：2019-01-29）