檢測(cè)豬O型口蹄疫免疫抗體的對(duì)比試驗(yàn)

孟虹英

（天康生物股份有限公司，新疆烏魯木齊 830000）

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

使用37℃恒溫生化培養(yǎng)箱、若干個(gè)單道、12 道移液器、若干個(gè)96 孔 U型反應(yīng)板、量筒100 ml 、iMark- 酶標(biāo)儀。

1.2 血清樣品

隨機(jī)采集血液樣品48分，但前提是樣品必須經(jīng)過(guò)豬口蹄疫 O型滅活疫苗二次免疫后約 40 d 的 95 ～ 120 日齡育肥，將血清進(jìn)行分離之后，放置于 4℃冰箱保存待測(cè)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 口蹄疫抗體 O 型競(jìng)爭(zhēng) ELISA

嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書開(kāi)展操作，對(duì)于兩孔的平均 OD 值后乘以 0.6進(jìn)行計(jì)算，所得的結(jié)果就是臨界值，主要是用來(lái)表示阻斷 40% 反應(yīng)的對(duì)照 OD 值。待測(cè)樣品OD 值 ＞ 臨界值，則判定結(jié)果為陰性孔；而如果待測(cè)樣品 OD 值≦臨界值的話，則表示為陽(yáng)性孔。陽(yáng)性孔最高的稀釋倍數(shù)就代表著該樣品的抗體效價(jià)，抗體效價(jià)＞1：16 判定抗體結(jié)果為合格。

1.3.2 口蹄疫抗體 O 型液相阻斷 ELISA

同樣嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書開(kāi)展相關(guān)操作，對(duì)于兩孔的平均OD 值進(jìn)行之后乘以 0.5，所得到的結(jié)果就代表著臨界值，表示阻斷 50% 反應(yīng)的對(duì)照 OD 值。待測(cè)樣品 OD 值 ＞ 臨界值，同樣表示陰性孔；而待測(cè)樣品的 OD 值如果≦臨界值的話，則意味著陽(yáng)性孔，陽(yáng)性孔的最高稀釋倍數(shù)就是該樣品的抗體效價(jià)，豬血清抗體效價(jià)≧ 1 ∶ 64 顯示抗體合格。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS22.0處理數(shù)據(jù)，使用（n，%）表示計(jì)數(shù)資料，組間差異以χ2、 t 檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

經(jīng)過(guò)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于其結(jié)果進(jìn)行分析，競(jìng)爭(zhēng) ELISA應(yīng)用于豬血清 O 型的檢測(cè)中，合格率為 91.7%；而液相 ELISA 的合格率也同樣為91.7%。對(duì)于豬血清 O 型抗體進(jìn)行的兩種方法檢測(cè)方法，其合格率符合度為 100%。

表1 兩種檢測(cè)方法對(duì)于豬 O 型口蹄疫免疫抗體的結(jié)果比較

基于抗體效價(jià)的整體結(jié)果而言，兩種檢測(cè)方式所得到的抗體效價(jià)不具有明顯的相關(guān)性，但是當(dāng)競(jìng)爭(zhēng) ELISA 測(cè)得的抗體效價(jià)≧1：180 的時(shí)候。兩種檢測(cè)方法中，競(jìng)爭(zhēng) ELISA 與液相 ELISA 的抗體效價(jià)為1：2。

3 討論

液相阻斷 ELISA 抗體檢測(cè)主要是采取雙抗體夾心法的模型，并將對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體，分別充當(dāng)為固相抗體、酶標(biāo)抗體。液相阻斷 ELISA 檢測(cè)方式主要是用于測(cè)定大分子抗原及對(duì)應(yīng)的抗體，而半抗原、小分子單價(jià)抗原及對(duì)應(yīng)的抗體則不適用，主要的原因是因?yàn)槠洳⒉荒苄纬蓛晌粌晌稽c(diǎn)夾心。在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)展，從而ELISA，所以ELISA是一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)。其檢測(cè)過(guò)程為抗原吸附在固相載體上，加待測(cè)抗體，添加相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體，使其可以生成抗體-待測(cè)抗體- 酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，并與該酶的底物進(jìn)行有色反應(yīng)，然后通過(guò)利用酶標(biāo)儀的光吸收對(duì)于抗體的量進(jìn)行計(jì)算。

本研究使用將小分子抗原包被在酶標(biāo)板上的方法，并在檢測(cè)過(guò)程中加入待測(cè)樣本，使酶標(biāo)板上的抗原與樣本中的待測(cè)抗體進(jìn)行結(jié)合。然后添加HRP 酶標(biāo)記抗體，并且該抗體也能夠與酶標(biāo)板上抗體產(chǎn)生結(jié)合的作用，因?yàn)槊笜?biāo)板上固定了一定數(shù)量的抗原之后，所以樣本中的抗體量越多，那么HRP 酶標(biāo)記抗體可以進(jìn)行結(jié)合的包被抗原將會(huì)越少。而兩種抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合包被抗體，因此，被稱之為競(jìng)爭(zhēng)法。

本次研究結(jié)果顯示，液相 ELISA 與競(jìng)爭(zhēng) ELISA 兩種檢測(cè)方法的抗體合格率所呈現(xiàn)出的結(jié)果為完全合格的狀態(tài)，并且對(duì)于同一血清的抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，并無(wú)明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。但是兩種檢測(cè)方式的敏感性、特異性均比較的高，試驗(yàn)方法科學(xué)合理，試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠。

本次檢測(cè)結(jié)果中，競(jìng)爭(zhēng) ELISA 的方法的抗體效價(jià)明顯低于液相 ELISA方法檢測(cè)樣品，原因可能是因?yàn)楦?jìng)爭(zhēng) ELISA 方法所使用的結(jié)合抗原為口蹄疫病毒 VP1 結(jié)構(gòu)蛋白，而液相 ELISA則是采用口蹄疫全病毒，全病毒結(jié)構(gòu)含有蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白，其反應(yīng)程度要比競(jìng)爭(zhēng) ELISA 方法更強(qiáng)。但是，如果增加稀釋滴度的話，那么其抗原抗體反應(yīng)特異性將會(huì)更加的明顯，所以，受到客觀因素所產(chǎn)生的影響也將會(huì)更小，因此兩種檢測(cè)方法之間所獲得抗體效價(jià)對(duì)應(yīng)關(guān)系會(huì)逐漸的趨向于穩(wěn)定狀態(tài)。