孟虹英
(天康生物股份有限公司,新疆烏魯木齊 830000)
使用37℃恒溫生化培養(yǎng)箱、若干個單道、12 道移液器、若干個96 孔 U型反應板、量筒100 ml 、iMark- 酶標儀。
隨機采集血液樣品48分,但前提是樣品必須經(jīng)過豬口蹄疫 O型滅活疫苗二次免疫后約 40 d 的 95 ~ 120 日齡育肥,將血清進行分離之后,放置于 4℃冰箱保存待測。
1.3.1 口蹄疫抗體 O 型競爭 ELISA
嚴格按照試劑盒說明書開展操作,對于兩孔的平均 OD 值后乘以 0.6進行計算,所得的結(jié)果就是臨界值,主要是用來表示阻斷 40% 反應的對照 OD 值。待測樣品OD 值 > 臨界值,則判定結(jié)果為陰性孔;而如果待測樣品 OD 值≦臨界值的話,則表示為陽性孔。陽性孔最高的稀釋倍數(shù)就代表著該樣品的抗體效價,抗體效價>1:16 判定抗體結(jié)果為合格。
1.3.2 口蹄疫抗體 O 型液相阻斷 ELISA
同樣嚴格按照試劑盒說明書開展相關操作,對于兩孔的平均OD 值進行之后乘以 0.5,所得到的結(jié)果就代表著臨界值,表示阻斷 50% 反應的對照 OD 值。待測樣品 OD 值 > 臨界值,同樣表示陰性孔;而待測樣品的 OD 值如果≦臨界值的話,則意味著陽性孔,陽性孔的最高稀釋倍數(shù)就是該樣品的抗體效價,豬血清抗體效價≧ 1 ∶ 64 顯示抗體合格。
采用SPSS22.0處理數(shù)據(jù),使用(n,%)表示計數(shù)資料,組間差異以χ2、 t 檢驗進行比較,P<0.05表示差異存在統(tǒng)計學意義。
經(jīng)過進行檢測,對于其結(jié)果進行分析,競爭 ELISA應用于豬血清 O 型的檢測中,合格率為 91.7%;而液相 ELISA 的合格率也同樣為91.7%。對于豬血清 O 型抗體進行的兩種方法檢測方法,其合格率符合度為 100%。
表1 兩種檢測方法對于豬 O 型口蹄疫免疫抗體的結(jié)果比較
基于抗體效價的整體結(jié)果而言,兩種檢測方式所得到的抗體效價不具有明顯的相關性,但是當競爭 ELISA 測得的抗體效價≧1:180 的時候。兩種檢測方法中,競爭 ELISA 與液相 ELISA 的抗體效價為1:2。
液相阻斷 ELISA 抗體檢測主要是采取雙抗體夾心法的模型,并將對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體,分別充當為固相抗體、酶標抗體。液相阻斷 ELISA 檢測方式主要是用于測定大分子抗原及對應的抗體,而半抗原、小分子單價抗原及對應的抗體則不適用,主要的原因是因為其并不能形成兩位兩位點夾心。在免疫酶技術的基礎上進行發(fā)展,從而ELISA,所以ELISA是一種新型的免疫測定技術。其檢測過程為抗原吸附在固相載體上,加待測抗體,添加相應的酶標記抗體,使其可以生成抗體-待測抗體- 酶標記抗體的復合物,并與該酶的底物進行有色反應,然后通過利用酶標儀的光吸收對于抗體的量進行計算。
本研究使用將小分子抗原包被在酶標板上的方法,并在檢測過程中加入待測樣本,使酶標板上的抗原與樣本中的待測抗體進行結(jié)合。然后添加HRP 酶標記抗體,并且該抗體也能夠與酶標板上抗體產(chǎn)生結(jié)合的作用,因為酶標板上固定了一定數(shù)量的抗原之后,所以樣本中的抗體量越多,那么HRP 酶標記抗體可以進行結(jié)合的包被抗原將會越少。而兩種抗原競爭結(jié)合包被抗體,因此,被稱之為競爭法。
本次研究結(jié)果顯示,液相 ELISA 與競爭 ELISA 兩種檢測方法的抗體合格率所呈現(xiàn)出的結(jié)果為完全合格的狀態(tài),并且對于同一血清的抗體效價進行檢測,結(jié)果顯示,并無明顯的對應關系。但是兩種檢測方式的敏感性、特異性均比較的高,試驗方法科學合理,試驗結(jié)果真實可靠。
本次檢測結(jié)果中,競爭 ELISA 的方法的抗體效價明顯低于液相 ELISA方法檢測樣品,原因可能是因為競爭 ELISA 方法所使用的結(jié)合抗原為口蹄疫病毒 VP1 結(jié)構(gòu)蛋白,而液相 ELISA則是采用口蹄疫全病毒,全病毒結(jié)構(gòu)含有蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白,其反應程度要比競爭 ELISA 方法更強。但是,如果增加稀釋滴度的話,那么其抗原抗體反應特異性將會更加的明顯,所以,受到客觀因素所產(chǎn)生的影響也將會更小,因此兩種檢測方法之間所獲得抗體效價對應關系會逐漸的趨向于穩(wěn)定狀態(tài)。