一例豬偽狂犬病毒實(shí)驗(yàn)室診斷報(bào)告

畢志學(xué) 胡標(biāo)猛 林 淼

（湖北省麻城市張家畈畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，湖北麻城 438300）

豬偽狂犬?。╬orcine pseudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（PRV，豬皰疹病毒Ⅳ型）引起的多種家畜、野生動(dòng)物的一種以發(fā)熱、奇癢（豬除外）、腦脊髓炎為主要臨床癥狀的急性傳染病。豬是該病的自然宿主和主要傳染源[1]。我國(guó)自 1948年劉永純報(bào)道該病以來(lái)，在多個(gè)?。ㄊ校┝餍小ｋm然我國(guó)大多數(shù)規(guī)?；i場(chǎng)采取了豬偽狂犬的凈化措施，但是由于我國(guó)養(yǎng)殖環(huán)境較為復(fù)雜，2012年以來(lái)豬偽狂犬病的發(fā)生在我國(guó)呈由北向南逐漸蔓延的趨勢(shì)，說(shuō)明偽狂犬病已依然是嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一。

2019年4月份XX地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)疑似出現(xiàn)豬偽狂犬病的疫情，母豬主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱仔，7日齡以內(nèi)仔豬多表現(xiàn)為口吐白沫，四肢呈劃水樣，頭向后仰等臨診癥狀，剖檢病豬多可見扁桃體發(fā)生潰瘍，肝臟表面出現(xiàn)大小不等的灰白色壞死灶，腎臟表面有大小不等的點(diǎn)狀出血。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)該豬場(chǎng)進(jìn)行血清學(xué)和病原學(xué)的檢測(cè)，確定此次疫情是由豬偽狂犬病毒變異株引起，并通過(guò)緊急免疫等手段成功的控制了疫情的蔓延，同時(shí)為養(yǎng)殖戶挽救巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集與處理

隨機(jī)抽取30份發(fā)病與正常母豬待檢血清，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采集自XX地區(qū)某規(guī)模化豬場(chǎng)流產(chǎn)胎兒、死胎及發(fā)病仔豬的腦、扁桃體、肺臟等組織，加適量滅菌的PBS液，研磨制成1：10的混懸液，反復(fù)凍融3次后在4℃條件下5000 r/min離心10 min，收集上清。置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

病毒 DNA/RNA 提取試劑盒、2 × EX Taq PCR 購(gòu)自、DNA Marker DL2000 等購(gòu)自 TaKaRa 公司；豬偽狂犬野毒抗體檢測(cè)試劑盒為IDEXX公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的合成

參考王宇等人發(fā)表的豬偽狂犬病毒gE基因合成2對(duì)豬偽狂犬病毒gE基因的特異性引物F1：5′-GACCATGCGGCCCTTTCTGC-3′，R1：5 ′ -GGTCCACCGGGCGCAGGCACTGC-3 ′；F2：5 ′ -GCCCCCGCGGTGCCTGCTGTA-3 ′，R2：5′-GTATTTAAGCGGGGCGGGACATCA-3′，其擴(kuò)增目的片段大小分別為為890bp、850bp。引物送上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2.2 血清學(xué)診斷

對(duì)發(fā)病豬群隨機(jī)采集30份血清，其中編號(hào)1～10號(hào)為流產(chǎn)母豬血清，11-25號(hào)為正常母豬血清，26～30號(hào)為發(fā)病仔豬血清。按照IDEXX公司豬為狂犬野毒抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書對(duì)待檢血清進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 基因組DNA的提取

采集自XX地區(qū)某規(guī)?；i場(chǎng)流產(chǎn)胎兒、死胎及發(fā)病仔豬的腦、扁桃體、肺臟等組織無(wú)菌條件下充分研磨，反復(fù)凍溶3次后，在4 ℃條件下12000 r/min離心10 min，取200 μl上清液于滅菌的1.5 ml離心管中，用X公司的動(dòng)物血液/組織/分泌物/培養(yǎng)細(xì)胞基因組DNA/RNA提取試劑盒按步驟提取病毒DNA，并以提取的病毒基因組DNA作為PCR擴(kuò)增的模板。

1.2.4 PCR擴(kuò)增及程序

反應(yīng)體系為50μl：2×EX Taq酶25 μl，上、下游引物各2 μl，DNA 模板 4 μl，滅菌雙蒸水 17 μl。

反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性10 min，95 ℃變性50 s，63℃ 退火50 s，72 ℃延伸100 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μlCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，觀察目的條帶大小。

1.2.5 序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析

PCR產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒純化回收目的片段，樣品送進(jìn)行序列測(cè)定，并利用DNAStar中的MegAlign等分子生物學(xué)軟件進(jìn)行核苷酸序列及氨基酸序列遺傳變異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

血清豬偽狂犬病毒檢測(cè)結(jié)果顯示，流產(chǎn)母豬豬為狂犬野毒抗體陽(yáng)性率為100%，其感染后S/N值抗體水平處于感染中后期的抗體水平，仔豬陽(yáng)性率為80%，其感染后S/N值相對(duì)處于一個(gè)感染初期的抗體水平，無(wú)異常母豬群陽(yáng)性率47%。

（備注：S/N≤0.6判為陽(yáng)性；S/N＞0.7判為陰性；0.7≥S/N＞0.6判為可疑。）

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用設(shè)計(jì)的2對(duì)特異性引物，通過(guò)PCR方法從采集的發(fā)病豬組織樣品中分別擴(kuò)增出F1/R1、F2/R2基因，其擴(kuò)增片段大小分別為890bp、850bp，與預(yù)期大小相符（見圖1）。

圖1 PRV gE基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 序列分析

利用ContigExpress軟件對(duì)1株豬偽狂犬病毒毒株F1/R1、F2/R2分段擴(kuò)增的gE基因進(jìn)行全基因序列的拼接，并與GenBank中已發(fā)表的豬偽狂犬病毒不同地區(qū)的代表株進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明分離的毒株全基因序列全長(zhǎng)為1740bp，編碼個(gè)氨基酸。利用生物學(xué)軟件DNAStar對(duì)所獲得的1株P(guān)RV gE全基因序列之間及其國(guó)內(nèi)外分離毒株進(jìn)行核苷酸遺傳進(jìn)化樹分析及同源性比較。結(jié)果表明與國(guó)內(nèi)分離的JS-2012株、ZM株、HB1株、Xiang A株，及國(guó)外分離的Rac1株共同在一個(gè)分支上，說(shuō)明本次檢測(cè)到的豬偽狂犬病毒與2011年后分離的變異毒株親緣關(guān)系較近。同時(shí)與國(guó)內(nèi)分離的經(jīng)典毒株LA、PRV-SH、Ea、GDSH、Min-A、P-PrV、Fa、SXJC2011毒株位于一個(gè)大的分支，說(shuō)明本次檢測(cè)到的毒株與這些毒株存在一定的親緣關(guān)系，另外這些經(jīng)典毒株有部分已經(jīng)作為疫苗株在我國(guó)廣泛使用，說(shuō)明以Ea株為代表的疫苗免疫產(chǎn)生的抗體能夠?qū)δ壳皣?guó)內(nèi)存在的豬偽狂犬病毒起到保護(hù)作用。而與國(guó)外代表毒株Becker、Nia-1、Kaplan等毒株不在一個(gè)分支上，說(shuō)明與這些毒株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其以這些毒株為基礎(chǔ)生產(chǎn)的疫苗在一定程度上的免疫效果相對(duì)稍差。同源性分析顯示本次檢測(cè)到的豬偽狂犬病毒與近年分離的變異毒株JS-2012株、ZM株同源性為100%、與HB1、Xiang A、Rac1、LA、PRV-SH、Ea、GDSH、Min-A、P-PrV、Fa、SXJC2011等毒株同源性均在99%以上，而與國(guó)外國(guó)外代表毒株Becker、Nia-1、Kaplan等毒株同源性為96%以上，這些結(jié)果表明本次檢測(cè)到的豬偽狂犬病毒與近年分離的變異毒株同源性最高，與國(guó)外分離毒株同源性相對(duì)較低，說(shuō)明本次檢測(cè)到的豬偽狂犬病毒為變異毒株。

3 討論

2011年以來(lái)，我國(guó)多個(gè)省份陸續(xù)報(bào)道了豬偽狂犬基因缺失疫苗免疫豬場(chǎng)發(fā)生豬偽狂犬病的疫情，新發(fā)豬偽狂犬病的發(fā)病率和死亡率明顯上升，且出現(xiàn)了新的發(fā)病特征[2]。據(jù)了解該豬場(chǎng)一直使用某進(jìn)口廠家Barth-K 61毒株疫苗，種豬群每年免疫4次，從2017年6月份種豬群豬偽狂犬野毒抗體出現(xiàn)大約5%陽(yáng)性率，后調(diào)整免疫劑量和免疫程序，生產(chǎn)處于相對(duì)較為穩(wěn)定狀態(tài)，直到今年3月份，母豬群突然出現(xiàn)大面積的流產(chǎn)現(xiàn)象，仔豬出現(xiàn)典型的偽狂犬感染癥狀，檢測(cè)結(jié)果顯示豬偽狂犬野毒抗體陽(yáng)性率已從5%上升為70%，豬偽狂犬病毒為陽(yáng)性。序列分析表明豬群存在的豬偽狂犬病毒與國(guó)內(nèi)近年分離的變異毒株JS-2012株、ZM株同源性為100%、與其他國(guó)內(nèi)分離毒株同源性均達(dá)到99%以上，與JS-2012株的親緣關(guān)系最近，說(shuō)明此次感染的豬偽狂犬病毒為變異毒株。針對(duì)此次疫情的發(fā)生，全群選用國(guó)產(chǎn)某廠家的豬偽狂犬病毒3基因缺失弱毒疫苗和滅活疫苗進(jìn)行緊急免疫，疫情逐漸得到有效控制。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)有不同毒株的國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口疫苗免疫后產(chǎn)生的中和抗體對(duì)新分離的豬偽狂犬病毒毒株中和能力較差，不足以提供完全保護(hù)，表明變異毒株可能存在一定的抗原變異[3]。豬偽狂犬病疫情在近年來(lái)的發(fā)生可能跟我國(guó)的養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān)系，主要是中小規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)缺乏有效的生物安全防范意識(shí)，疫苗接種不到位，免疫程序不合理，生長(zhǎng)商品豬長(zhǎng)期處于免疫抗體空白期等因素導(dǎo)致疫情的發(fā)生率居高不下。因此筆者建議中小規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)一定要加強(qiáng)生物安全防范意識(shí)，做好后備豬引種的監(jiān)測(cè)，定期對(duì)整個(gè)豬群進(jìn)行抗體水平的監(jiān)測(cè)工作，制定合理的免疫程序，選擇免疫效果好、抗原含量高的疫苗進(jìn)行免疫，采取綜合性的、系統(tǒng)性的防控手段才能有效控制豬偽狂犬病的發(fā)生，最終做到豬偽狂犬病的凈化。

圖2 PRV gE 基因核苷酸同源性分析