美洲大蠊提取物抑制LPS誘導(dǎo)的人牙齦細胞與牙周膜細胞的炎癥反應(yīng)

薛麗 張雙 高鷹 李黎仙 杜俊蓉

目前，抗生素是臨床牙周病治療的常用藥物，但長期服用抗生素不僅容易產(chǎn)生耐藥性，而且會進一步加重口腔菌群紊亂、促進疾病發(fā)展[1]。人牙齦成纖維細胞(human gingival fibroblasts,HGFs)和牙周膜細胞(human periodontal ligament cells，HPDLCs)是牙周組織的主要細胞類別[2]。研究表明，牙周組織感染的細菌裂解后釋放脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，可作用于HGFs與HPDLCs細胞膜上模式識別受體Toll 樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)，從而激活TLR4/NF-κB信號通路，上調(diào)NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控的多種炎癥因子的表達，介導(dǎo)牙周組織的炎癥反應(yīng)和損傷，促進牙周病的發(fā)生發(fā)展[3]。因此，建立體外原代的HGFs與HPDLCs細胞模型，篩選干預(yù)LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的有效天然產(chǎn)物，可望為進一步研發(fā)安全有效的牙周病防治健康產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

美洲大蠊(Periplanetaamericana L．)，屬于昆蟲綱蜚蠊科蜚蠊亞目，俗稱“蟑螂”，其藥用歷史悠久，可用于治療兒童疳積、扁桃腺炎、癰瘡腫痛等。近年來，人們對美洲大蠊的研究日益增多，研究結(jié)果顯示美洲大蠊具有促進傷口愈合、抗肝炎、抗?jié)?、提高免疫力等多種藥理活性[4-8]；肖小芹等[9]報道美洲大蠊提取物(periplanetaamericana extract，PAE)具有顯著的抗炎活性，可抑制小鼠耳廓炎性腫脹和大鼠足跖炎性腫脹。目前，PAE對牙周病的研究尚未見報道。本實驗旨在從細胞水平探討PAE對LPS誘導(dǎo)的2 種人源牙周病細胞模型的炎癥反應(yīng)的影響及潛在的作用機制，以期為牙周病的防治提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 細胞與藥物來源

人牙齦成纖維細胞和牙周膜細胞源于四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院；PAE源于云南白藥集團股份有限公司。

1.2 試劑

LPS(E. coli O55:B5)(Sigma公司,美國)；DMSO、MTT、青霉素和鏈霉素(Amresco公司,美國)；α-MEM培養(yǎng)基(Hyclone公司,美國)；胎牛血清(北京民海生物科技有限公司)；IL-6 ELISA試劑盒(北京達科為生物技術(shù)有限公司)；羊抗兔NF-κB-p65單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；兔抗MMP2多克隆抗體(沈陽萬類生物科技有限公司)；兔抗TLR4單克隆抗體、羊抗兔FITC、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒、Mayor's蘇木素(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)。

1.3 細胞培養(yǎng)

將凍存的原代HPDLCs和HGFs復(fù)蘇，用α-MEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素)，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按1∶3傳代，選取4～8 代細胞用于實驗。

1.4 實驗分組

將HGFs和HPDLCs隨機分為對照組，LPS組(1 μg/ml LPS)和PAE干預(yù)組。其中HGFs細胞所用PAE藥物濃度分別為0. 5、1和2 mg/ml(PAE-0.5組，PAE-1組，PAE-2組)，HPDLCs細胞所用PAE藥物濃度分別為0.05、 0.1和 0.2 mg/ml PAE(PAE-0.05組，PAE-0.1組，PAE-0.2組)。

1.5 MTT法測定PAE對細胞活性的影響

將細胞懸浮液 (1×104個/孔) 接種于96 孔板，于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，按分組給藥，每組設(shè)3 個復(fù)孔，24 h后，每孔加入10 μl(5 mg/ml)MTT ，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，常溫下震蕩10 min。于490 nm 波長處測吸光度值，計算細胞存活率(細胞存活率=實驗組A490/空白組A490×100%)。實驗重復(fù)3 次。

1.6 ELISA法測定IL-6含量

將生長良好的HGFs和HPDLCs(1×104個/孔)接種于96 孔板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按分組給藥，每組設(shè)9 個復(fù)孔，收集細胞培養(yǎng)上清，按ELISA試劑盒說明書檢測IL-6含量。

1.7 免疫染色法測定TLR4、MMP2的表達及NF-κB-p65的核轉(zhuǎn)狀況

將生長良好的HGFs和HPDLCs(1.5 ×104個/孔)接種于含細胞爬片的24 孔板，于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。按實驗分組進行TLR4、MMP2和NF-κB-p65的免疫染色，光學(xué)顯微鏡下觀察TLR4、MMP2的陽性表達及NF-κB-p65的核轉(zhuǎn)狀況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 PAE對HGFs和HPDLCs細胞活性的影響

與對照組相比，LPS組、PAE干預(yù)組HGFs(表 1)和HPDLCs(表 2)細胞活性均無顯著差異(P>0.05)。

組別LPS濃度(μg/ml)PAE濃度(mg/ml)細胞存活率(%)對照組——100.0±3.6模型組1—101.0±3.5①PAE-0.510.5106.0±3.2①PAE-111105.6±3.2①PAE-212103.1±1.6①

注： ①與對照組比較，P>0.05

組別LPS濃度(μg/ml)PAE濃度(mg/ml)細胞存活率(%)對照組——100.0±2.7模型組1—101.4±1.8①PAE-0.0510.05103.8±1.5①PAE-0.110.1102.4±2.4①PAE-0.210.2101.2±6.2①

注： ①與對照組比較，P>0.05

2.2 PAE對IL-6含量的影響

與對照組相比，LPS組IL-6含量顯著增高，表明LPS誘導(dǎo)可引起細胞的炎癥反應(yīng)。與LPS組相比，PAE干預(yù)組HGFs中IL-6含量呈濃度依賴性的下降，其中PAE-2組(2 mg/ml)顯著下降(A)；PAE干預(yù)組HPDLCs中IL-6含量呈濃度依賴性顯著下降(B)，表明PAE抑制牙齦成纖維細胞(A)和牙周膜細胞(B)IL-6的分泌(圖 1)。

圖 1 PAE抑制人牙齦成纖維細胞(A)和牙周膜細胞(B)IL-6的生成

2.3 PAE對TLR4與MMP2蛋白表達的影響

如圖 2，與對照組相比，LPS組的TLR4和MMP2陽性表達顏色較深，表明LPS組的TLR4和MMP2蛋白表達明顯上調(diào)。與LPS組相比，PAE-2組(2 mg/ml)和PAE-0.2組 (0.2 mg/ml) TLR4和MMP2陽性表達顏色明顯變淺，提示PAE能有效抑制TLR4和MMP2的蛋白表達。

2.4 PAE對NF-κB活化的影響

如圖 3，對照組NF-κB-p65基本分布在胞漿中，LPS組NF-κB-p65核內(nèi)轉(zhuǎn)明顯增多，PAE-2組(2 mg/ml)和PAE-0.2組(0.2 mg/ml)NF-κB-p65的核內(nèi)轉(zhuǎn)明顯減少，提示PAE能有效抑制NF-κB活化。

圖 2 PAE對人牙齦成纖維細胞和牙周膜細胞TLR4和MMP2蛋白表達的影響 (免疫組化， ×200)

Fig 2 The effects of PAE on the expression of TLR4 and MMP2 in HGFs and HPDLCs (IHC， ×200)

3 討 論

牙周病是常見的口腔炎癥性疾病，其主要致病因子是革蘭氏陰性菌的LPS[3]。研究表明，大腸桿菌的LPS與牙周病致病菌牙卟啉單胞菌和伴放線菌聚集菌共享宿主細胞反應(yīng)的生物活性，引發(fā)炎癥反應(yīng)[10-11]。牙齦成纖維細胞和牙周膜細胞是牙周組織的主要細胞群，在牙周組織的再生和修復(fù)中起重要作用[2]。在正常狀態(tài)下，二者能夠合成、分泌少量的膠原酶和其他金屬蛋白酶，維持細胞外基質(zhì)。在病理狀態(tài)下，HGFs和HPDLCs被炎癥介質(zhì)激活，合成及分泌MMPs和炎癥因子增加，促使細胞外基質(zhì)降解[2]。研究表明，與正常人相比，牙周病患者牙周組織中MMP2、IL-6等的表達顯著增加[12]。因此，本實驗采用大腸桿菌的LPS來刺激HGFs和HPDLCs建立牙周病體外細胞模型，探討PAE對LPS誘導(dǎo)的HGFs和HPDLCs炎癥反應(yīng)的作用及潛在作用機制。

圖 3 PAE對人牙齦成纖維細胞和牙周膜細胞NF-κB活化的影響 (免疫熒光技術(shù)， ×400)

Fig 3 The effects of PAE on the activation of NF-κB in HGFs and HPDLCs (Immunofluore scence, ×400)

TLR4是LPS的第一模式識別受體[3]，不僅存在于單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞表面，還存在于牙周組織的牙齦成纖維細胞和牙周膜細胞等非免疫細胞表面[2]。LPS與細胞膜TLR4結(jié)合后，通過一系列磷酸化的級聯(lián)反應(yīng)，促使NF-κB-p65核內(nèi)轉(zhuǎn)，通過與核內(nèi)下游靶基因結(jié)合，促進其轉(zhuǎn)錄及表達，進而誘發(fā)IL-6等細胞因子和MMP2等基質(zhì)金屬蛋白酶的炎癥表達[13-14]。研究表明，LPS刺激30 min到1 h后，可激活TLR4/NF-κB信號通路的炎癥反應(yīng)[15]。因此，本實驗選擇LPS作用1 h后，檢測TLR4 /NF-κB信號通路及炎癥介質(zhì)表達。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS組TLR4與MMP2表達、NF-κB-p65活化及IL-6的產(chǎn)生明顯增多，PAE-2和PAE-0.2組TLR4與MMP2表達、NF-κB-p65活化及IL-6的產(chǎn)生明顯減少。

綜上所述，PAE可能通過TLR4/NF-κB信號通路，抑制IL-6的分泌，下調(diào)MMP2表達，抑制LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞和牙周膜細胞的炎癥反應(yīng)。目前，以PAE為有效成分的上市藥物主要包括康復(fù)新、肝龍膠囊、心脈隆注射液等，分別用于潰瘍性結(jié)腸炎、乙型肝炎及心衰的治療。本研究結(jié)果為PAE應(yīng)用于牙周病防治提供了新的實驗依據(jù)。值得注意的是，PAE對HGFs和HPDLFs 2 種牙周病細胞模型的有效劑量分別是2 mg/ml和0.2 mg/ml，表明HGFs和HPDLFs對PAE的敏感性存在差異。因此，PAE用于在牙周病防治的量效關(guān)系還需開展體內(nèi)有效性研究。