納米鉭種植體對兔脛骨修復部位微環(huán)境影響

郝春波 王周凱欣

種植體修復是口腔牙列的缺損與缺失重要的治療方法，如何提高種植體的成功率成了最為主要的問題，對患者種植體修復能夠成功起到了決定性的作用[1]。種植體與牙槽之間通過骨合作用形成牢固結合，種植體表面的化學修飾對整個骨結合的過程具有實質上的影響，通過改變表面的化學成分，金屬材料會具備更加高的生物活性，從而有效地促進與骨組織之間的愈合狀態(tài)[2]。鈦種植體是目前最常采用的一類種植體，在臨床獲得廣泛的應用[3]。但隨著口腔醫(yī)學的發(fā)展，鈦種植體的許多問題得以暴露，如何進行骨的誘導效應以及生物活性亦或是尋找更加有效的金屬種植體更了醫(yī)學界的研究熱點[4]。研究顯示鉭金屬與機體有非常好的生物相容性，可以和成骨細胞發(fā)生一定的結合反應，且不會引起機體發(fā)生中毒等不良反應[5]。本實驗將比較了納米鉭種植體與純鈦種植體在植入兔脛骨后對修復部位微環(huán)境的影響，力求為納米鉭種植體在人體內的成骨結合作用提供微環(huán)境融合方面的借鑒。

1 材料與方法

1.1 動物

30 只5 月齡新西蘭大白兔，均為雄性，2～3 kg，常規(guī)喂養(yǎng)，隨機分為純鈦種植體組與納米鉭種植體組，每組15 只。

1.2 試劑與材料

單面刀片、蠟鏟、臺木、切片機、切片刀、毛筆、蠟帶盤、水浴鍋、染色缸、載玻片(Beyotime公司)；蘇木素染液(Leagen公司)；PCR儀、實時熒光定量PCR儀7500型(ABI公司，美國)；0.25%胰蛋白酶消化液、青霉素、鏈霉素(Gibco公司，美國)；RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司，德國)；TaqMan反轉錄試劑盒、2×TaqMan快速通用PCR反應液(Applied Biosystems公司，美國)；4%戊巴比妥溶液(SIGMA公司，美國)及由生工生物工程上海股份有限公司合成引物(表 1)。

表 1 引物名稱及序列

1.3 方法

1.3.1 脛骨種植體植入[6]5 月齡雄性新西蘭大白兔30 只，隨機分為純鈦種植體組與納米鉭種植體組(n=15)。耳緣靜脈注射30 mg/kg戊巴比妥鈉全麻下，在雙側脛骨近心端離脛骨頭(0.5～1.0 mm)骨嵴內側骨面，以球鉆定位，先鋒鉆裂鉆制備出寬3.3 mm深度為8.0 mm的洞形。將純鈦種植體與納米鉭種植體擰入骨組織，末端平齊骨緣，分層嚴密縫合，術后抗炎3 d，進行常規(guī)喂養(yǎng)。

1.3.2 種植體周圍組織學取材 術后每組在1、4和8 周各處死2 只新西蘭大白兔，注射過量4%戊巴比妥，在種植體周圍環(huán)形切取軟組織，儲存于-80 ℃冰箱內保存。

1.3.3 形態(tài)學切片制作和觀察 4%多聚甲醛固定新西蘭白兔種植周圍組織標本，常規(guī)制片，蘇木精、伊紅染色。中性樹膠封后于顯微鏡下觀察。

1.3.4 熒光定量PCR檢測 取術后1 周時處死的大白兔的種植體周圍軟組織，采用RNeasy Mini Kit提取總RNA，逆轉錄反應合成cDNA，反應條件為：25 ℃ 30 min→42 ℃ 30 min→85 ℃ 5 min。以cDNA為模板，采用2×TaqMan快速通用PCR反應液進行熒光定量檢測PCR，反應條件：95 ℃ 3 min→(95 ℃ 30 s→64.5 ℃ 45 s→72 ℃ 1 min)×40 個循環(huán)，4 ℃保溫，于62 ℃時采集熒光信號。以GAPDH作為參比，計算TNF-α、IL-6與IL-1β mRNA表達水平，相對含量=2-△△Ct，其中△△Ct=△Ct樣本目的基因-△Ct樣本GAPDH。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 術后種植體周圍組織形態(tài)變化分析

本研究2 組新西蘭大白兔均存活，且種植體周圍骨組織與種植體接觸界面上有著較好的整合；通過對2 種種植體術后1、4、8 周的組織學觀察，可以發(fā)現(xiàn)2 組在術后1 周均有較多的中性粒細胞浸潤，相對于純鈦種植體組的生長變化，納米鉭種植體組在4 周后有較多的新骨層，到第8周，能看到更大面積的基質骨的形成；HE切片染色顯示圖顯示納米鉭種植體組具有更好的成骨細胞生長性，種植體與周圍組織形態(tài)的切合率更高(圖 1)。

2.2 種植體周圍軟組織TNF-α、IL-6與IL-1β mRNA表達情況分析

納米鉭種植體組種植體周圍軟組織中促炎因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達水平均顯著高于純鈦種植體組(P<0.05)，2 組IL-6的mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖 2)。

3 討 論

鉭材料在醫(yī)學領域中逐漸表現(xiàn)出良好和廣泛應用性，大量實驗數(shù)據(jù)證實鉭植入人體后不會造成損傷，肌肉組織切片在鉭材料上有著良好的生長分裂，充分證實鉭金屬與機體有非常好的生物相容性[7]。因此自從上個世紀40年代開始這種金屬逐漸在醫(yī)學各專業(yè)上得到了很好的推廣與應用，從心臟起搏器、修復神經的金屬絲、骨頭缺損的修復方面均能看到它發(fā)揮作用的身影，在醫(yī)學領域的應用越來越受到關注[8]。這都為鉭作為口腔醫(yī)學種植體的應用做了很好的鋪墊研究。目前尚缺少納米鉭金屬種植體植入后修復部位炎癥反應和微環(huán)境變化的研究報道，本研究將納米鉭金屬種植體與傳統(tǒng)使用的純種鈦種植體進行了對比，力求為納米鉭種植體在人體內的成骨結合作用提供微環(huán)境融合方面的借鑒。

圖 1 2 組種植體術后種植體周圍組織形態(tài)學改變 (HE)

Fig 1 Morphological changes of the microenvironment around implants in the 2 groups (HE)

圖 2 術后1 周2 組種植體周圍軟組織炎性因子mRNA水平比較

Fig 2 Comparison of mRNA levels of inflammatory factors in soft tissue around the implants between the 2 groups 1 week postoperation

本研究結果顯示2 組材料種植體周圍骨組織與種植體接觸界面上均有著較好的整合，通過對2 種種植體術后1、4、8 周的組織學觀察，可以發(fā)現(xiàn)2 組在術后1 周均有較多的中性粒細胞浸潤，相對于純鈦種植體組的生長變化，納米鉭種植體組在4 周后有較多的新骨層，到第8周，能看到更大面積的基質骨的形成；HE切片染色顯示圖顯示納米鉭種植體組具有更好的成骨細胞生長性，種植體與周圍組織形態(tài)的切合率更高。提示納米鉭種植體在一定的培養(yǎng)時期后，出現(xiàn)新的骨層以及更大面積基質骨的幾率更大，初步證明了納米鉭種植體在口腔種植體中較鈦金屬的優(yōu)勢所在。

本研究通過對2 種種植體周圍軟組織術后1 周后的TNF-α、IL-6 與IL-1β mRNA 的表達水平比較，發(fā)現(xiàn)促炎因子TNF-α、IL-1β在純鈦種植體組的表達水平顯著高于納米鉭種植體組要高出許多，兩組IL-6表達水平無顯著差異，提示納米鉭種植體組的種植體術后炎癥反應較純鈦種植體組低，顯示納米鉭種植體術后發(fā)生種植體周圍炎風險更低，充分說明了納米鉭種植體與周圍的骨組織具有較好的融合性，成骨細胞的排斥性更低，側面證實后后期骨結合效率的有效提高性。種植體周圍組織中一旦發(fā)生炎癥，這些炎癥能夠迅速地從周圍組織向結締組織甚至骨組織中發(fā)展，而在牙周組織中的發(fā)展要明顯慢得多[9-10]。

綜上，納米鉭種植體組的種植體術后炎癥反應較純鈦種植體組低，從而推測納米鉭種植體術后發(fā)生種植體周圍炎風險更低。