東北地區(qū)狐源大腸桿菌磺胺類(lèi)耐藥基因的檢測(cè)與分析

鞠明霖 柴 榮 馮子軒 張 喆 薛 原

(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，哈爾濱，150040)

中國(guó)的狐類(lèi)動(dòng)物養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)已有較長(zhǎng)的歷史，目前還在不斷地發(fā)展之中，由于氣候、籠舍建設(shè)、環(huán)境條件以及預(yù)防衛(wèi)生措施等問(wèn)題，狐大腸桿菌引起的疾病發(fā)生頻繁，對(duì)狐類(lèi)動(dòng)物的養(yǎng)殖有極大影響。因大腸桿菌(Escherichiacoli)能遺傳抗生素的耐藥基因[1]，其耐藥基因的研究更成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外關(guān)于禽源、豬源、牛源等食品動(dòng)物源大腸桿菌耐藥基因檢測(cè)的研究較多，而對(duì)于狐類(lèi)動(dòng)物的大腸桿菌耐藥基因的研究報(bào)道很少。

磺胺類(lèi)藥物在抗細(xì)菌、抗真菌、抗癌、抗寄生蟲(chóng)、消炎鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗驚厥等多個(gè)醫(yī)藥領(lǐng)域顯示巨大開(kāi)發(fā)價(jià)值[2]。在前期已對(duì)大腸桿菌進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)的基礎(chǔ)上，本研究隨機(jī)采集了涵蓋黑龍江、吉林、遼寧三省多個(gè)狐養(yǎng)殖場(chǎng)的156株樣本，針對(duì)狐源大腸桿菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)和分析，了解東北地區(qū)狐源大腸桿菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物的耐藥情況，為實(shí)現(xiàn)狐類(lèi)養(yǎng)殖中科學(xué)合理用藥、有效防治疾病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

從黑龍江、吉林、遼寧部分狐養(yǎng)殖場(chǎng)采集樣本，并運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，經(jīng)分離鑒定，共有156株大腸桿菌。

1.1.2 儀器

PCR儀德國(guó)Biometra公司產(chǎn)品、凝膠成像分析系統(tǒng)美國(guó)Alpha Imager 2200公司產(chǎn)品。

1.1.3 試劑

Buffer、dNTP、rTaq、DNA Maker、TaqMix等購(gòu)于寶生物有限公司。

1.1.4 引物合成

參照Sunde和Norstr?m[3]合成sulⅠ、sulⅡ和sulⅢ磺胺類(lèi)耐藥基因的引物。

1.2 方法

1.2.1 耐藥基因的PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系：取156株樣品進(jìn)行體系配置。25 μL反應(yīng)體系配置如下：Buffer加入2.5 μL，dNTP加入2.0 μL，上游、下游兩條引物各加入0.5 μL，去離子水加入18 μL，rTaq加入0.25 μL，樣品DNA模板加入2 μL。將體系搖勻后放入PCR儀器中進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)過(guò)程：95℃下進(jìn)行預(yù)變性5 min，94℃開(kāi)始變性1 min，退火45℃ 1 min，72℃下延伸1 min，循環(huán)35次，最后一次72℃下延伸5 min，4℃預(yù)冷3 min。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物放入1%瓊脂糖培養(yǎng)基中進(jìn)行電泳，使用GoldVlewⅠ型核酸染色劑進(jìn)行染色，將電泳結(jié)果放在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果拍攝。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

以狐源大腸桿菌的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的sulⅠ、sulⅡ和sulⅢ的基因片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得預(yù)期長(zhǎng)度的電泳條帶，部分結(jié)果見(jiàn)圖1，圖2，圖3。

圖1 耐藥基因sulⅠPCR產(chǎn)物電泳結(jié)果M.Marker 2000；1—6.部分菌株耐藥基因Fig.1 Electrophoresis results of sulⅠ PCR products of drug resistance geneM.Marker 2000.1-6.Drug resistance genes of some strains

圖2 耐藥基因sulⅡPCR產(chǎn)物電泳結(jié)果M.Marker 2000；1—5.部分菌株耐藥基因Fig.2 Electrophoresis results of sulⅡ PCR products of drug resistance geneM.Marker 2000.1-5.Drug resistance genes of some strains

圖3 耐藥基因sulⅢPCR產(chǎn)物電泳結(jié)果M.Marker 2000；1—6.部分菌株耐藥基因Fig.3 Electrophoresis results of sul Ⅲ PCR products of drug resistance geneM.Marker 2000.1-6.Drug resistance

2.2 磺胺類(lèi)耐藥基因檢測(cè)結(jié)果與分析

狐源大腸桿菌的樣本共有156株，經(jīng)PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物的檢測(cè)，得出檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。其中156株樣本中磺胺類(lèi)藥物的耐藥性耐藥基因sulⅠ、sulⅡ和sulⅢ均有測(cè)出，分別為19.23%(30/156)、44.87%(70/156)、20.51%(32/156)。此結(jié)果還具有明顯的地域差異：在黑龍江的93株樣本中sulⅠ、sulⅡ和sulⅢ的檢出率分別為25.81%(24/93)、45.16%(42/93)、29.03%(27/93)，在吉林的24株樣本中sulⅠ、sulⅡ和sulⅢ的檢出率分別為16.67%(4/24)、91.67%(22/24)、8.33%(2/24)，在遼寧的39株樣本中sulⅠ、sulⅡ和sulⅢ的檢出率分別為5.13%(2/39)、15.38%(6/39)、7.69%(3/39)。

表1 156株狐源大腸桿菌磺胺類(lèi)耐藥性統(tǒng)計(jì)Tab.1 Statistics of sulfonamide resistance of 156 strains of fox-derived Escherichia coli

3 討論

大腸桿菌是一類(lèi)普遍存在于自然界，并能引發(fā)人和動(dòng)物共同感染的輕微或嚴(yán)重的人畜共患病病原。根據(jù)養(yǎng)殖場(chǎng)的衛(wèi)生條件、管理水平、用藥習(xí)慣，養(yǎng)殖動(dòng)物的患病情況也各不相同，如成年母畜感染大腸桿菌常引起流產(chǎn)和死胎，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)較大經(jīng)濟(jì)損失[4]。

磺胺類(lèi)藥物具備抗菌譜廣、價(jià)錢(qián)低廉、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、應(yīng)用便利等長(zhǎng)處，能抑制大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和某些陰性菌，是常用的抗菌藥物，也是廣泛使用的抗生素。其抗菌機(jī)理是干擾細(xì)菌的葉酸代謝，使細(xì)菌的生長(zhǎng)、繁殖受到抑制。磺胺類(lèi)藥物常用來(lái)預(yù)防和治療狐類(lèi)等毛皮動(dòng)物的部分疾病，但如果被長(zhǎng)期或過(guò)量等不當(dāng)使用，則會(huì)導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生或其耐藥能力的增強(qiáng)，從而減弱磺胺類(lèi)藥物的藥效，影響疾病防治效果，甚至對(duì)養(yǎng)殖造成不可估量經(jīng)濟(jì)損失。此外，磺胺類(lèi)藥物在水體中的殘留可對(duì)公共健康構(gòu)成潛在威脅[5]。

根據(jù)磺胺類(lèi)藥物耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，黑龍江地區(qū)的狐類(lèi)對(duì)磺胺類(lèi)的藥品耐藥性總體上要略高于其他兩個(gè)地區(qū)，已經(jīng)呈現(xiàn)出較嚴(yán)重的耐藥性。但其檢出率仍低于其他地區(qū)的牛[6]、兔[7]、禽類(lèi)[8]等養(yǎng)殖動(dòng)物。由相對(duì)較低的檢出率可推測(cè)出在東北地區(qū)狐類(lèi)毛皮動(dòng)物的養(yǎng)殖過(guò)程中對(duì)磺胺類(lèi)藥物的投喂時(shí)間較短或藥量較少。目前東北是中國(guó)狐類(lèi)毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖的主要地區(qū)，但將狐類(lèi)作為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物進(jìn)行規(guī)?；B(yǎng)殖時(shí)間相較禽類(lèi)、豬、牛等短，只有近幾十年的歷史，這可能是本次實(shí)驗(yàn)檢出率低于其他動(dòng)物的主要原因。我們可以通過(guò)聯(lián)合用藥、加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、保證用藥的療程與藥量、嘗試使用新型獸藥等途徑，盡可能減少飼養(yǎng)動(dòng)物對(duì)某一藥物的耐藥性。從東北地區(qū)養(yǎng)殖狐貍分離得到的大腸桿菌為對(duì)象，對(duì)其磺胺類(lèi)藥物的耐藥基因進(jìn)行了檢測(cè)分析，該結(jié)果可為狐類(lèi)養(yǎng)殖過(guò)程中臨床合理用藥提供有力的參考依據(jù)。