非洲企鵝微衛(wèi)星DNA的篩選及其遺傳多樣性分析

袁耀華 耿廣耀 楊淑慧 馬 躍 徐艷春*

(1.上海動(dòng)物園，上海，200335；2.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，哈爾濱，150040)

非洲企鵝(Spheniscusdemersus)又名斑嘴環(huán)企鵝，與麥哲倫企鵝(S.magellanicus)、加島環(huán)企鵝(S.mendiculus)、洪堡企鵝(S.humboldti)同屬企鵝目(Sphenisciformes)，企鵝科(Spheniscidae)，環(huán)企鵝屬。因?yàn)椴稓?、撿拾鳥卵、石油污染、沿海生態(tài)系統(tǒng)的破壞、不斷擴(kuò)大的商業(yè)捕魚、棲息地喪失、清理鳥糞做肥料等人類活動(dòng)，導(dǎo)致野外非洲企鵝數(shù)量銳減，目前存活數(shù)目?jī)H為80年前的2.5%[1]。20世紀(jì)末，上海動(dòng)物園先后從日本、荷蘭的動(dòng)物園引進(jìn)非洲企鵝進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖，目前已突破人工繁育的技術(shù)問題，且建立了較大的飼養(yǎng)種群。在種群發(fā)展過(guò)程中，主要采用人工配對(duì)方式，所以后代的譜系關(guān)系不清楚；另一方面，建群者個(gè)體數(shù)目只有10只，又沒有進(jìn)一步的種源引入，可能存在近親繁殖。這兩種情況都可能導(dǎo)致原本不太高的遺傳多樣性在今后的繼續(xù)繁殖中進(jìn)一步下降。因此，對(duì)當(dāng)前種群的遺傳多樣性進(jìn)行系統(tǒng)研究，為種群遺傳管理提供依據(jù)。目前為止，關(guān)于非洲企鵝的研究較少，主要集中在人工繁育技術(shù)[2-3]和野外種群波動(dòng)及其影響因素[4-5]等方面，關(guān)于微衛(wèi)星DNA的篩選及遺傳多樣研究等方面均未見報(bào)道。本研究利用已知的其他企鵝微衛(wèi)星基因座在非洲企鵝中進(jìn)行測(cè)試，篩選擴(kuò)增效果良好，且具有較高多態(tài)性的微衛(wèi)星，組成非洲企鵝微衛(wèi)星分析系統(tǒng)，并用以分析該種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 材料

對(duì)上海動(dòng)物園飼養(yǎng)的非洲企鵝種群，除少數(shù)個(gè)體采用體檢所剩的血液樣品以外，從每只個(gè)體的胸部拔取廓羽3—5枚，裝入紙質(zhì)信封內(nèi)，通風(fēng)處自然干燥，然后放入-20℃冰箱內(nèi)保存。血液樣本灌注于無(wú)菌的棉紗布中，避光通風(fēng)處自然干燥，裝入紙質(zhì)信封后放入-20℃冰箱內(nèi)保存。

1.2 DNA的提取

每只個(gè)體取羽毛3枚，將羽軸基部0.5 cm處剪下，置于干凈的試管中，在95%的乙醇中震蕩漂洗5 min，轉(zhuǎn)入去離子水中漂洗5 min，然后置于TNE緩沖液洗滌中浸泡1 h。采用基因組DNA提取試劑盒(AxyPrep Biosciences，杭州)提取總DNA。干血樣品的DNA提取時(shí)，先將帶血漬的紗布剪下0.5 cm2，置于TNE緩沖液洗滌中浸泡1 h，然后采用相同的試劑盒提取總DNA。提取的DNA經(jīng)過(guò)測(cè)定OD260估算濃度，然后稀釋成10 ng/μL備用。

1.3 微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選

從參考文獻(xiàn)中[6-9]選擇28個(gè)微衛(wèi)星PNN01、PNN03、PNN05、PNN06、PNN07、PNN08、PNN09、PNN012、FHU2、TP500、RM6、RM3、AM12、AM13、AM3、B3-2、G3-11、G3-6、G2-2、H2-6、M1-11、SH1CA9、SH1CA12、SH1CA16、SH1CA17、SH2CA12、SH2CA21和SH2CA22，各位點(diǎn)的重復(fù)單元長(zhǎng)度為2—4 bp。用文獻(xiàn)中的引物和擴(kuò)增條件擴(kuò)增非洲企鵝DNA。擴(kuò)增前，把每個(gè)位點(diǎn)上游引物的5′端用FAM熒光染料標(biāo)記，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所獲得的引物序列、退火溫度等信息見表1。

表1 微衛(wèi)星位點(diǎn)的信息Tab.1 Information of microsatellites used in this study

續(xù)表1

PCR反應(yīng)在50 μL體系中進(jìn)行，包括25 μL PrimerSTAR Max Premix(2×)(Takara，大連)，上下游引物各0.2 μmol/L，DNA模板50 ng。擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf Master cycler pro PCR儀上完成，98℃/10 s；(98℃/10 s，Ta/15 s，72℃/10 s)× 30 cycle；72℃/1.5 min。PCR產(chǎn)物用ABI 3100型遺傳分析儀(Applied Biosystems，美國(guó))電泳分離，用GeneScan 3.1軟件(Applied Biosystems，美國(guó))收集數(shù)據(jù)，用Genotyper 3.1軟件(Applied Biosystems，美國(guó))測(cè)量擴(kuò)增產(chǎn)物大小，并識(shí)別等位基因。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用軟件Cervus 3.0對(duì)基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到觀測(cè)雜合度、期望雜合度、等位基因數(shù)、有效基因數(shù)、基因頻率、基因型頻率、排除率、個(gè)體識(shí)別力、親權(quán)分析等。利用軟件PopGene對(duì)該群體每個(gè)位點(diǎn)的Hardy-Weinberg平衡進(jìn)行卡方(χ2)檢驗(yàn)，利用Coancestry估計(jì)該圈養(yǎng)種群的近交系數(shù)。

2 研究結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星遺傳多樣性

相比血液樣品，羽毛樣品的總DNA提取量較少，但是所有的樣品都足夠用于微衛(wèi)星擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，28個(gè)微衛(wèi)星中有17個(gè)在非洲企鵝上無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，包括PNN07、PNN08、FHU2、TP500、RM3、AM12、AM13、AM3、G3-11、G3-6、M1-11、SH1CA9、SH1CA12、SH1CA16、SH1CA17、SH2CA12和SH2CA22，其余11個(gè)有擴(kuò)增產(chǎn)物，但PNN05、RM6和H2-6等3個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為單態(tài)，PNN01、PNN03、PNN06、PNN09、PNN012、G2-2、B3-2和SH2CA21 8個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性。

在46個(gè)個(gè)體中，上述8個(gè)多態(tài)位點(diǎn)上共檢測(cè)到34個(gè)等位基因(表2)，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為3—6個(gè)，平均4.25個(gè)。等位基因數(shù)最多的是PNN03，共檢測(cè)到6個(gè)等位基因，其次是PNN06、PNN012和SH2CA21，均檢測(cè)到5個(gè)等位基因。在PNN09檢測(cè)到4個(gè)等位基因，PNN01、G2-2和B3-2各檢測(cè)到3個(gè)等位基因。有效等位基因數(shù)在PNN09最大，為3.56；B3-2最小為1.57，平均為2.71個(gè)。8個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度為0.435—0.804，平均為0.614；期望雜合度0.366—0.726，平均為0.618。8個(gè)位點(diǎn)中，多態(tài)性信息含量在0.330—0.667，PNN09最高為0.667，B3-2最低為0.330。通過(guò)χ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，8個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中PNN03顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，PNN01偏離Hardy-Weinberg平衡，其他6個(gè)位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡。

2.2 非親排除率與親權(quán)鑒定

依據(jù)各位點(diǎn)的基因頻率、基因型頻率計(jì)算各位點(diǎn)的非親排除概率(NEP)，各位點(diǎn)非親排除概率和累計(jì)排除概率見表3。對(duì)第一親本的非親排除概率為0.707—0.935，對(duì)第二親本的非親排除概率為0.536—0.814，對(duì)親本對(duì)的非親排除概率0.362—0.690。 8個(gè)多態(tài)位點(diǎn)雙親累計(jì)排除概率(E-PP)為0.998。

通過(guò)Cervus 3.0軟件，共鑒定出15對(duì)父-母-子，包括31個(gè)個(gè)體。據(jù)此繪制了3個(gè)譜系關(guān)系(圖1)。

2.3 個(gè)體雜合度與個(gè)體近交系數(shù)

根據(jù)各個(gè)體的基因型，計(jì)算個(gè)體雜合度與標(biāo)準(zhǔn)個(gè)體雜合度，由表4可以看出該圈養(yǎng)種群個(gè)體雜合度為0.250—1.000，標(biāo)準(zhǔn)雜合度為0.405—1.618。利用Coancestry采用LH-estimator和LR-estimator兩種估計(jì)方法估計(jì)個(gè)體近交系數(shù)，該圈養(yǎng)種群的個(gè)體近交系數(shù)的范圍為-0.304—1.617(LH-estimator)和-0.402—0.750(LR-estimator)，二者的平均值分別為0.045和0.052，從數(shù)值上看，該群體既存在近交，同時(shí)也存在明顯的近交避免機(jī)制。

表2 人工飼養(yǎng)非洲企鵝種群中8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳特征Tab.2 Characteristics of 8 microsatellites in the captive African penguin Spheniscus demersus population

表3 人工飼養(yǎng)非洲企鵝種群中8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的非親排除概率Tab.3 Non-parent exclusive probabilities of 8 microsatellites in the captive African penguin Spheniscus demersus population

圖1 人工飼養(yǎng)非洲企鵝31只個(gè)體的譜系關(guān)系圖Fig.1 The pedigree chart of 31 captive African penguins

表4 個(gè)體雜合度與標(biāo)準(zhǔn)個(gè)體雜合度Tab.4 Multilocus heterozygosity and standard multilocus heterozygosity

3 討論

鳥類取樣一般分為3類：傷害性取樣、非傷害性取樣、非損傷取樣。傷害性取樣即殺害動(dòng)物采樣或抽取1 mL以上的血液，一般不適用于珍稀鳥類。本研究采用非傷害性取樣拔取胸部廓羽和體檢剩余血液作為研究對(duì)象，雖然血液樣本中總DNA含量遠(yuǎn)高于廓羽中總DNA含量，但在遺傳多樣性分析中胸部廓羽DNA含量和血液DNA未因含量變化發(fā)生差異。在以后相關(guān)研究中采樣可以采用非傷害性取樣，盡可能避免應(yīng)激對(duì)動(dòng)物的傷害。

該研究選取了28個(gè)微衛(wèi)星引物，經(jīng)過(guò)一系列的篩選最終確定了8對(duì)具有多態(tài)性的引物。其中PNN01，PNN03，PNN06，PNN09，PNN012來(lái)源于非洲企鵝，再次證實(shí)了這5個(gè)位點(diǎn)在非洲企鵝中的穩(wěn)定存在，其中PNN012擴(kuò)增率較其他幾個(gè)位點(diǎn)略低，在以后的非洲企鵝相關(guān)研究中應(yīng)該慎重考慮。SH2CA21來(lái)源于洪堡企鵝，在非洲企鵝群體中有較好的遺傳多態(tài)性，具有一定的研究?jī)r(jià)值，對(duì)以后洪堡企鵝和非洲企鵝的物種進(jìn)化研究起到一定的作用。B3-2和G2-2是通過(guò)磁珠富集法獲得的位點(diǎn)引物，在麥哲倫企鵝和加島環(huán)企鵝種群成功擴(kuò)增且有較高的多態(tài)性，本研究也證實(shí)了該位點(diǎn)在非洲企鵝種群中的普遍存在。SH2CA21，B3-2，G2-2位點(diǎn)有較好通用性，有助于企鵝目的比較遺傳圖譜的構(gòu)建。

有效等位基因數(shù)是群體隨機(jī)交配能夠穩(wěn)定遺傳給后代的基因數(shù)，等位基因數(shù)反映的是該位點(diǎn)的遺傳變異水平，一般等位基因數(shù)越大，該基因適應(yīng)環(huán)境變化的潛力也越大。有效等位基因數(shù)和觀察等位基因數(shù)的差值可以反映該位點(diǎn)等位基因丟失的風(fēng)險(xiǎn)。8個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為3—6，平均4.25，有效等位基因?yàn)?.57—3.56，平均2.71。觀察等位基因數(shù)和有效等位基因差距較大，說(shuō)明上海動(dòng)物園非洲企鵝種群中有部分低頻等位基因有丟失的風(fēng)險(xiǎn)。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)顯示PNN03、PNN01顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，占總位點(diǎn)數(shù)的25%，與現(xiàn)用非隨機(jī)配對(duì)方式有關(guān)。其他6個(gè)位點(diǎn)未偏離Hardy-Weinberg平衡這說(shuō)明現(xiàn)用配對(duì)方式對(duì)當(dāng)前遺傳多樣性的影響還比較小，此時(shí)為加強(qiáng)遺傳管理的好時(shí)機(jī)。

采用此套遺傳標(biāo)記利用Cervus 3.0軟件在親本未知情況下，鑒定出了15組血緣關(guān)系，其他個(gè)體未能成功檢出親緣關(guān)系，這可能是由親本信息未采集導(dǎo)致。在以后種群管理中適當(dāng)增加攜帶稀有基因(P<0.05)個(gè)體的繁殖機(jī)會(huì)，以期稀有基因得以保留。

4 結(jié)論

位點(diǎn)PNN01、PNN03、PNN06、PNN09、PNN012、G2-2、B3-2和SH2CA21多態(tài)性較高，且累積非親排除率也較高，可以用于譜系勘誤、親權(quán)分析，在利用該研究遺傳標(biāo)記進(jìn)行遺傳管理時(shí)，需配合SPARKS和PMX等軟件。在條件允許的情況下，對(duì)未確定基因指紋的個(gè)體進(jìn)行個(gè)體基因指紋制定，此外單個(gè)位點(diǎn)非親排除率較低，可以進(jìn)一步尋找更多的位點(diǎn)提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。