五種基于CHD基因的性別鑒定方法對(duì)雀形目鳥類有效性的實(shí)驗(yàn)評(píng)估

蘇 倡 李顯達(dá) 邢曉瑩 李 波，3 馬 躍，3 吳 偉 徐艷春，3*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，哈爾濱，150040；2.黑龍江中央站黑嘴松雞自然保護(hù)區(qū)管理局，嫩江，161499；3.國家林業(yè)和草原局野生動(dòng)植物檢測中心，哈爾濱，150040)

性別鑒定是鳥類研究工作的一項(xiàng)基礎(chǔ)工作[1]，在種群監(jiān)測、行為研究、性比分析、婚配系統(tǒng)分析、引種繁育、飼養(yǎng)管理、疾病防治和遺傳進(jìn)化等諸多方面都具有十分重要的作用[1-2]。全世界現(xiàn)存的9 800多種鳥類中有50%的物種是單態(tài)型鳥類[3]，表現(xiàn)為雌雄體色十分相似，通過羽色、體尺等形態(tài)學(xué)指標(biāo)判定其性別比較困難。人們根據(jù)經(jīng)驗(yàn)建立了一些方法來判別單態(tài)型鳥類的性別，例如：體尺測量、鳴聲判定、翻肛鑒別、腹腔鏡檢、類固醇鑒定和核型分析等[2]。這些方法中，如體尺、鳴聲、類固醇水平等方法可靠性差；翻肛鑒別、腹腔鏡檢和核型分析等方法要么耗時(shí)長，價(jià)格昂貴，操作過程繁瑣，要么對(duì)鳥類健康帶來傷害，甚至危及生命[4-5]。鳥類性別鑒定的困難為鳥類學(xué)研究和監(jiān)測工作帶來了很多不便[6]。

鳥類性染色體上存在著哺乳動(dòng)物對(duì)應(yīng)的染色體螺旋蛋白結(jié)合基因(CHD)[7]，該基因在Z染色體和W染色體上的同源序列之間外顯子高度保守，而內(nèi)含子序列和大小差異很大[7]。由于大多數(shù)鳥類性染色體表現(xiàn)為雄性同配(ZZ型)、雌性異配(ZW型)，所以雄鳥只有CHD-Z基因，而雌鳥有兩個(gè)同源拷貝即CHD-Z和CHD-W[3]。根據(jù)這個(gè)特性，在內(nèi)含子兩側(cè)的保守序列上設(shè)計(jì)PCR引物，Z染色體和W染色體上的擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)表現(xiàn)出片段大小的差異，借此可判斷鳥類性別[3，8]：有一個(gè)條帶的為雄性個(gè)體，有兩條大小不同條帶的為雌性個(gè)體。

根據(jù)這一原理，Griffiths等設(shè)計(jì)了鳥類性別鑒定引物P2、P3，通過PCR擴(kuò)增的方法成功鑒定了野生金剛鸚鵡(Cyanopsittaspixii)的性別[9]。因?yàn)檫@一鑒別采用的 PCR策略具有鑒定快速、特異性高、通用性高、取材容易且采樣量小等優(yōu)點(diǎn)[10]，在后來的鳥類性別鑒定中被廣泛采用[11]。

雀形目(Passeriformes)有5 700余種，占全世界現(xiàn)存鳥類種數(shù)的60%[12]，單態(tài)型鳥類很多，通過體色和體型等外部特征鑒定其性別比較困難。因而，CHD基因的PCR方法就成為單態(tài)型鳥類性別鑒定的主要方法[11，13-15]。但是由于雀形目種類繁多、適應(yīng)輻射極廣[16]，且數(shù)量龐大，所以基因的變異較多，經(jīng)常因?yàn)镻CR引物通用性不夠而導(dǎo)致部分物種甚至部分個(gè)體的CHD基因很難擴(kuò)增[17]。目前，文獻(xiàn)報(bào)道較多的有5對(duì)CHD基因通用引物用于雀形目鳥類性別鑒定，包括P2/P8[3]、2550F/2718R[18]、CHD1F/CHD1R[15]、sex1’/sex-mix[11]和IntP2/IntP8[17](表1)。文獻(xiàn)中都明確闡述了這些方法的有效性，但在實(shí)際工作中，效果并不很理想。在森林鳥類環(huán)志和種群監(jiān)測中，主要單態(tài)型雀形目鳥類采用這些方法是否有效還不清楚。本研究以柳鶯科(Phylloscopidae)、鹡鸰科(Motacillidae)和巖鷚科(Prunellidae)鳥類為對(duì)象，評(píng)估了上述5對(duì)引物在其性別鑒定中的有效性，為這些鳥類種群性別結(jié)構(gòu)分析提供借鑒。

表1 5對(duì)引物成功鑒定性別的雀形目鳥類信息Tab.1 Application of five universal PCR primer pairs of CHD gene for sexing Passerine birds

續(xù)表1

注：文獻(xiàn)中一些種類的科的劃分與《中國鳥類分類與分布名錄》(第三版)[20]稍有差異
Note：Family affiliation of some species in these cited literatures is different from the present used taxonomy described inAChecklistontheClassificationandDistributionoftheBirdsofChina(third edition)[20]

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所需樣品大部分來自黑龍江高峰鳥類保護(hù)環(huán)志站(49°06′N，125°15′E)和東北林業(yè)大學(xué)帽兒山鳥類環(huán)志站(45°24′N，127°39′E)。在鳥類環(huán)志工作的同時(shí)，采用霧網(wǎng)捕捉的方法在野外捕捉雀形目鳥類共6種214只，分別為樹鷚(Anthushodgsoni)20只、棕眉山巖鷚(Prunellamontanella)35只、黃眉柳鶯(Phylloscopusinornatus)76只、黃腰柳鶯(Ph.proregulus)36只、褐柳鶯(Ph.fuscatus)20只和灰腳柳鶯(Ph.tenellipes)27只。這6種鳥類均為單態(tài)型，表現(xiàn)為雌雄同色[21]，依靠形態(tài)學(xué)方法不能有效區(qū)分其性別。環(huán)志過程中，將鳥從霧網(wǎng)上取下，完成戴腳環(huán)、體尺測量、稱重、記錄后，用潔凈的鑷子從其胸腹部不同位置拔取3—5根廓羽[5，22]，不影響其體形輪廓，然后放飛。將羽毛置于紙質(zhì)樣品袋中，標(biāo)記采集時(shí)間、環(huán)號(hào)等信息，室溫干燥保存。此外，國家林業(yè)和草原局野生動(dòng)植物檢測中心惠贈(zèng)了20只柳鶯科及棕眉山巖鷚死體(表2)。將每只個(gè)體剖開腹腔，探查卵巢和睪丸等器官，判斷其性別，然后采集肌肉組織少許，提取DNA，考察每對(duì)引物擴(kuò)增的正確性。

表2 20只性別鑒定陽性對(duì)照鳥類信息Tab.2 The information of 20 birds used as positive control in sexing experiments

1.2 總DNA的提取與PCR擴(kuò)增

用滅菌的解剖剪剪取羽毛基部2 mm[5，22]，置于1.5 mL離心管中，加入消化液：310 μL TNE buffer(pH=8)、20 μL蛋白酶K(10 mg/mL)、20 μL 1mol/L DTT，56℃恒溫消化過夜，直至羽根完全溶解，用DNA提取試劑盒(AxyPrep Biosciences，杭州)提取總DNA。提取肌肉組織的DNA時(shí)，取肌肉組織 50 mg 于1.5 mL 離心管中，用滅菌的眼科剪將其剪成碎塊，依次加入消化液：295 μL TNE buffer(pH=8)、25 μL蛋白酶K(10 mg/mL)、35 μL 10%SDS溶液，56℃水浴消化1 h以上，再用相同的方法提取總DNA。

提取的DNA用NanoPhotometer-N50超微量紫外分光光度計(jì)(德國Implen公司)測量濃度，統(tǒng)一稀釋到約10 ng/μL的濃度備用。

PCR反應(yīng)在10 μL體系中進(jìn)行，包括正反向引物各0.2 μL(10 μmol/L)、2×EasyTaq SuperMix(Transgen，北京)5 μL、ddH2O 1.8 μL、DNA模板3 μL。陰性對(duì)照采用ddH2O為模板，其余組分完全相同。擴(kuò)增采用PE-9700型DNA擴(kuò)增儀(PE，美國)，反應(yīng)程序?yàn)?4℃/3 min預(yù)變性，94℃/30 s再變性，50℃/45 s退火(P2/P8，CHD1F/CHD1R，2550F/2718R退火溫度為48℃，sex1’/sex-mix退火溫度為50℃，IntP2/P8退火溫度為51℃，退火溫度也會(huì)因物種不同而做適當(dāng)調(diào)整)，72℃/50 s延伸，共循35次，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離(80V穩(wěn)壓，1 h)，以DL1000 marker和DL2000 marker(Takara)為分子量標(biāo)準(zhǔn)估算擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，用凝膠成像儀拍照并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果[11]。

為了評(píng)估5對(duì)引物擴(kuò)增的靈敏度，在性別已知的5種20只鳥類中找出同時(shí)滿足以下兩個(gè)條件的物種：一是該物種至少包含雌雄兩個(gè)個(gè)體，二是5對(duì)引物均能穩(wěn)定擴(kuò)增這兩個(gè)體的DNA。最終選定編號(hào)為10#和11#的褐柳鶯雌雄個(gè)體。將其DNA稀釋為7個(gè)濃度梯度，分別是20 ng/μL、10 ng/μL、5 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL以及1 pg/μL。在10 μL的體系中，DNA模板的最終濃度分別是2 ng/μL、1 ng/μL、500 pg/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL以及0.1 pg/μL。用同樣的電泳方法記錄擴(kuò)增結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 5對(duì)性別鑒定引物鑒定的正確率和成功率

用5對(duì)引物對(duì)性別已知的20只鳥類的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比較PCR鑒定和解剖學(xué)鑒定的結(jié)果是否一致。結(jié)果如表3，P2/P8、sex1’/sex-mix和IntP2/IntP8在20只個(gè)體中的擴(kuò)增成功率為100%，2550F/2718R有1只個(gè)體沒有成功擴(kuò)增，成功率為95%，CHD1F/CHD1R擴(kuò)增的成功率最低，僅為70%。在正確率上，CHD1F/CHD1R、sex1’/sex-mix和IntP2/IntP8都有1只個(gè)體的PCR性別判定結(jié)果與解剖學(xué)判定的不同，錯(cuò)誤率為95%。P2/P8和2550F/2718R 的錯(cuò)誤率較高，分別為20%和15%。因此，sex1’/sex-mix和IntP2/IntP8的正確率和成功率最佳。

表3 5對(duì)引物性別鑒定的正確率Tab.3 Sexing correctness of five pairs of primers

2.2 5對(duì)引物PCR體系的靈敏度

靈敏度測試結(jié)果如圖1、表4。引物P2/P8的體系在較高的DNA濃度條件下擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果比較清晰、準(zhǔn)確，呈現(xiàn)出雌性為2個(gè)條帶，雄性為1個(gè)條帶。但是當(dāng)DNA濃度降低時(shí)，即使同一樣品，重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)PCR擴(kuò)增效果也不穩(wěn)定，當(dāng)模板DNA終濃度低于500 pg/μL時(shí)便無擴(kuò)增產(chǎn)物檢出。這一結(jié)果也與以往的一些研究相符[11]。引物CHD1F/CHD1R和2550F/2718R擴(kuò)增體系的靈敏度相似，都表現(xiàn)出雄性單條帶，雌性雙條帶。雖然在模板DNA濃度在10 pg/μL時(shí)也有擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，但100 pg/μL以后擴(kuò)增就不夠穩(wěn)定，電泳條帶經(jīng)常很淡，甚至不易辨認(rèn)。引物sex1’/sex-mix體系的效果最好，擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定，電泳結(jié)果清晰、準(zhǔn)確。同時(shí)，在10 pg/μL的低濃度DNA條件下仍能顯示出微弱但清晰可辨的條帶。引物IntP2/IntP8擴(kuò)增效果也很好，在100 pg/μL的DNA濃度下條帶顯示良好，但模板濃度低至10 pg/μL時(shí)則沒有擴(kuò)增條帶。以上結(jié)果表明，引物sex1’/sex-mix擴(kuò)增體系的靈敏度最高，IntP2/IntP8次之，CHD1F/CHD1R和2550F/2718R居中，P2/P8最差。

2.3 5對(duì)引物擴(kuò)增成功率的大樣本測試

根據(jù)靈敏度測試結(jié)果，在10 μL PCR反應(yīng)體系中，采用10 ng DNA模板，在保證各對(duì)引物能夠穩(wěn)定擴(kuò)增的前提下，用6個(gè)物種214只個(gè)體的大樣本評(píng)估每對(duì)引物擴(kuò)增的成功率。

如表5所示，引物P2/P8和CHD1F/CHD1R總擴(kuò)增成功率仍然很低，均低于60%。P2/P8擴(kuò)增片段長度為300—400 bp，在W染色體上擴(kuò)增片段大于Z染色體的擴(kuò)增片段；CHD1F/CHD1R與P2/P8相反，在CHD-W的擴(kuò)增片段小于CHD-Z的擴(kuò)增片段，兩片段長度范圍約為300—600 bp。

引物2550F/2718R擴(kuò)增片段長度約為500—700 bp，CHD-W的擴(kuò)增片段小于CHD-Z擴(kuò)增的片段，總成功率為85%。但其W染色體擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶經(jīng)常不太清晰，表明2個(gè)片段擴(kuò)增效率不平衡。使用該對(duì)引物擴(kuò)增樹鷚DNA時(shí)，除CHD-W和CHD-Z基因的擴(kuò)增產(chǎn)物外，幾乎所有個(gè)體均有1條250 bp左右的非特異性條帶，但該條帶對(duì)性別判定沒有影響。

表4 5對(duì)性別鑒定引物擴(kuò)增體系靈敏度的測試結(jié)果Tab.4 Sensitivity of PCR systems of five primers pairs for sex identification

圖1 不同模板濃度下5對(duì)引物擴(kuò)增體系的靈敏度Fig.1 Sensitivity of five pairs of primers amplifying a series of template concentrations 注：各電泳圖中，奇數(shù)泳道為10#♀，偶數(shù)泳道為11#♂。模板濃度1、2泳道 為2 ng/μL；3、4泳道為1 ng/μL；5、6泳道為500 pg/μL；7、8泳道為100 pg/μL；9、10泳道為10 pg/μL；11、12泳道為1 pg/μL；13、14泳道為0.1 pg/μL；15泳道為陰性對(duì)照(ddH2O)；M：marker DL2 000(TaKaRa) Note：In each electrophorogram，odd lanes are sample 10#♀ and even lanes are sample 11#♂.The concentrations of template are：Lane 1 and 2：2 ng/μL，Lane 3 and 4：1ng/μL，Lane 5 and 6：500 pg/μL，Lane 7 and 8：100 pg/μL，Lane 9 and 10：10 pg/μL，Lane 11 and 12：1 pg/μL，Lane 13 and 14：0.1 pg/μL.Lane 15 is negative control(ddH2O).M：marker DL2 000(TaKaRa)

引物sex1’/sex-mix的總擴(kuò)增成功率97%，兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶均比較清晰。兩片段長度為250—300 bp，CHD-W擴(kuò)增片段大于CHD-Z擴(kuò)增片段。但部分黃眉柳鶯雌性個(gè)體的CHD-W片段有優(yōu)先擴(kuò)增現(xiàn)象，致使一部分個(gè)體的電泳圖上所見CHD-Z片段條帶偏粗或在250 bp大小的區(qū)段存在2條相距很近的條帶。

引物IntP2/IntP8總擴(kuò)增成功率63%，CHD-W擴(kuò)增片段大于CHD-Z擴(kuò)增片段，兩片段長度為250—300 bp。

3 討論

性別鑒定中，某種方法是否具有實(shí)用意義主要看3個(gè)方面的表現(xiàn)：鑒別的正確率、PCR反應(yīng)的靈敏度和鑒別的成功率。正確率顯然是第一重要的，一種方法不能有足夠高的正確率，將會(huì)對(duì)種群性比的估算帶來偏差，如果選擇繁殖個(gè)體，則可能錯(cuò)誤地選擇了同性個(gè)體。正確率未知的情況下，這些偏差是無法糾正的。

本研究的評(píng)估顯示，在20只已知性別的個(gè)體中，引物sex1’/sex-mix和IntP2/IntP8的正確率最高，均達(dá)到了95%，引物P2/P8和2550F/2718R次之，均為80%，而引物CHD1F/CHD1R的正確率最低，僅有65%(表2)。這些錯(cuò)誤主要來自CHD-W或CHD-Z基因其中的一個(gè)擴(kuò)增失敗，未出現(xiàn)假陽性擴(kuò)增的現(xiàn)象。這說明，正確率低的原因更有可能是在引物區(qū)的堿基變異沒有包含在引物中，如果采用簡并引物來包含這些變異，可能會(huì)有所改善。就目前對(duì)所測試的雀形目鳥類來說，sex1’/sex-mix和IntP2/IntP8是比較可靠的。

靈敏度是反應(yīng)體系能夠擴(kuò)增出來的最低模板量。一個(gè)體系的靈敏度越高，就越可能節(jié)省模板，越適合于微量材料。羽毛是DNA含量較低的材料，與肌肉和血液樣本不同，從羽毛樣品得到的總DNA濃度通常較低[23]，所以越靈敏的PCR體系，在實(shí)際應(yīng)用中越有價(jià)值。

本研究評(píng)估顯示，5對(duì)引物中引物sex1’/sex-mix的靈敏度最高，達(dá)到10 pg/μL，IntP2/IntP8次之，為10—100 pg/μL，CHD1F/CHD1R和2550F/2718R為100 pg/μL，P2/P8最差，僅為500 pg/μL(表4)。體系的靈敏度主要取決于引物的摩爾數(shù)與模板DNA和目的片段的摩爾數(shù)之比。反應(yīng)體系中，引物的摩爾數(shù)是確定的，而模板DNA目的片段的摩爾數(shù)存在一定的不確定性。因?yàn)镈NA會(huì)發(fā)生化學(xué)降解和機(jī)械剪切，機(jī)械剪切往往容易發(fā)生在較大片段的中部，而酶促降解則較多發(fā)生在特定的位置。因?yàn)椴煌瑯悠繁４鏃l件不同，所經(jīng)歷的機(jī)械剪切和酶促降解也有所不同，因此，體系中雖然加入等量的模板DNA，但不同樣品的反應(yīng)中DNA片段數(shù)和保留完整的目的片段數(shù)都有所差異。從表4可以看出，如果DNA較少的時(shí)候，引物sex1’/sex-mix的表現(xiàn)最優(yōu)，IntP2/IntP8次之。

表5 5對(duì)性別鑒定引物擴(kuò)增成功率Tab.5 The success rate of five primers pairs for sex identification

成功率是除了正確率以外最為關(guān)心的問題。一個(gè)PCR體系能否擴(kuò)增成功，除了引物質(zhì)量和濃度、酶活力、離子強(qiáng)度、體系pH及緩沖能力、反應(yīng)程序及執(zhí)行質(zhì)量等因素以外，單純從模板因素考慮，引物區(qū)的變異度是第一大影響因素。越是靠近引物3′端的變異越容易導(dǎo)致PCR失敗，直接降低成功率。對(duì)于雀形目鳥類，遺傳多樣性較高，種群內(nèi)的變異度較高，CHD基因不同區(qū)段的變異度不同[24]。在不同區(qū)段上設(shè)計(jì)引物，受到的影響程度就會(huì)不同。我們采用大樣本測試發(fā)現(xiàn)，引物sex1’/sex-mix的總擴(kuò)增成功率最高，達(dá)到97%；引物2550F/2718R次之，達(dá)到85%；其余3對(duì)引物的擴(kuò)增成功率僅在63%或更低。

綜上所述，從鑒定正確率、反應(yīng)體系靈敏度和鑒定成功率3個(gè)指標(biāo)組合分析，對(duì)樹鷚、棕眉山巖鷚、黃眉柳鶯、黃腰柳鶯、褐柳鶯和灰腳柳鶯這6種單態(tài)型鳥類，引物sex1’/sex-mix是性別鑒定的最優(yōu)選擇，引物IntP2/IntP8和2550F/2718R可以慎用，而引物P2/P8和CHD1F/CHD1R不建議使用。