熊貓源唾液乳桿菌的分離鑒定及部分生物學特性分析

王黎明 張文平 王 潔 謝軍金 周杰瓏*

(1.西南林業(yè)大學生命科學學院，昆明，650224；2.成都大熊貓繁育研究基地，成都，610081)

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)是僅僅分布在中國四川、甘肅、陜西三省的特有物種，雖然近幾年大熊貓棲息地保護工程取得了巨大成就，大熊貓數(shù)量有所上升，已經(jīng)達到2 000只左右[1]。大熊貓在漫長的進化歷史中，仍保留著肉食性動物的胃腸道，沒有盲腸、腸道短且結(jié)構(gòu)簡單，食物通過速度非?？?，致使食物不能充分發(fā)酵，并且竹子中的營養(yǎng)水平較低。早期研究證明，在這種飲食情況下，為滿足機體營養(yǎng)所需，大熊貓體內(nèi)的腸道微生物進化并適應(yīng)以竹子為主的飲食，在營養(yǎng)物質(zhì)消化中起到重要的吸收和轉(zhuǎn)運功能。不久前研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物幫助大熊貓更好地消化竹子中的淀粉、半纖維素、果膠等容易消化的成分獲取能量，更加表明在大熊貓從出生到亞成體這一食物轉(zhuǎn)變過程中腸道微生態(tài)平衡的重要性[2]?？墒牵笮茇堅谑澄镛D(zhuǎn)變過程中，易出現(xiàn)消化功能不良，免疫力下降，腹瀉，導致腸道正常菌群失衡進一步引發(fā)嚴重的腸道疾病甚至死亡的情況[3]。

抗生素具有治療和預防疾病的作用，但隨著抗生素濫用導致社會對抗生素殘留、耐藥細菌的產(chǎn)生、和二重感染的擔憂，許多國家限制了非治療性抗生素在動物生產(chǎn)上的使用[4-5]。最近幾年隨著研究者對腸道菌群在疾病發(fā)生過程中的作用的不斷認識，益生菌作為一種抗疾病的替代品越來越受到人們的重視，益生菌通過調(diào)節(jié)黏膜和全身免疫功能以及改善腸道微生物營養(yǎng)平衡對宿主產(chǎn)生有益影響[6-7]。益生菌(Probiotics)定植于宿主腸道、生殖道、口腔等。常見的益生菌主要包括芽孢桿菌(Bacillus)、乳酸菌(lactic acid bacteria)、酵母菌(yeast)等，其中乳酸菌在促進人和動物健康，減少抗生素使用、特殊的風味和益生作用等方面越來越受到重視。乳酸菌具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌、抗應(yīng)激以及抗心血管相關(guān)疾病等作用[8-9]。早在1988年王強等[10]就開展了對大熊貓源益生菌的研究。雷蕾等[11]從17只健康成年大熊貓糞便中分離鑒定出13株乳酸菌。陳新亮等[12]從健康散養(yǎng)的溜達雞小腸黏膜中分離出1株唾液乳桿菌LactobacillussalivariusC-1-3。發(fā)現(xiàn)其對常見的致病菌大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonellaparatyphi)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)都具有良好的抑制作用，且該菌株能夠降解纖維素。李琳琳等[13]采集陜西八眉豬的糞便和腸道組織，篩選出1株耐受性和抑菌性良好，生長曲線穩(wěn)定且黏附性較好的乳酸菌。Wang等[14]從雞腸道中分離的1株唾液乳桿菌，發(fā)現(xiàn)不僅能夠產(chǎn)生膽鹽水解酶而且通過進一步研究表明膽鹽水解酶抑制劑將有望作為AGPs的替代物來改善動物的生長性能。在21世紀“保菌”時代，乳酸菌既可以作為微生態(tài)制劑應(yīng)用于畜牧行業(yè)中，也可以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)、食品行業(yè)、醫(yī)藥和化妝品行業(yè)以及口服疫苗生產(chǎn)等。鑒于此，本研究旨在從處于食物轉(zhuǎn)變期的幼年健康大熊貓糞便中分離生物學特性優(yōu)良的乳酸菌，為研究、開發(fā)和利用熊貓源微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

指示菌：大腸桿菌CMCCB44102、金黃色葡萄球菌CMCCB50094、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CMCCB10104、乙型副傷寒沙門氏菌CMCCB50094，標準菌株LGG(Lactobacillusrhamnosus)ATCC7496均購置廣東環(huán)凱微生物有限公司。Man-Ragosa-Sharpe(MRS)(購自青島高科園海博生物科技有限公司)。藥敏紙片(購自杭州微生物試劑有限公司)。溶菌酶、細菌基因組DNA 提取試劑盒(離心柱型)均購自北京天根生物科技有限公司。2×PCR Master Mix購自生工生物工程(上海)有限公司。細菌通用引物(27F，1492R)和耐藥基因引物的合成及16S rDNA均由測序生工生物工程(上海)有限公司完成。乳酸菌成套生理生化鑒定管(購自青島高科園海博生物科技有限公司)。

1.2 樣品采集與菌株分離

采集成都大熊貓繁育研究基地12個月左右的2只健康、發(fā)育良好的雙胞胎大熊貓(芝麻，芝士)的新鮮全糞，排出后立即放入無氧環(huán)境的凍存盒中4℃保存，20 min內(nèi)運至實驗室。選取大熊貓糞樣的中間部位且不挨著地面部分稱取5 g糞加入裝有45 mL無菌生理鹽水藍蓋瓶(帶玻璃珠)中于300 rpm的搖床震蕩15 min后制成10-1稀釋液，隨后按10倍稀釋法分別制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的糞樣稀釋液。取100 μL稀釋樣液均勻涂布MRS平板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)48 h后，接種環(huán)挑取疑似乳酸菌單個菌落在MRS平板上反復劃線純化，直至鏡檢無雜菌。

1.3 細菌的生態(tài)學鑒定

通過革蘭氏染色、乙酰甲基甲醇(V-P)試驗、吲哚試驗、糖發(fā)酵試驗(杭州微生物有限公司)、觸酶試驗、明膠液化試驗、硝酸鹽還原試驗、H2S生成試驗、15℃、 45℃ 及pH4.5生長試驗，將分離得到的細菌再做進一步鑒定分類。

(1)采用細菌基因組DNA 提取試劑盒(離心柱型)(北京天根生物科技有限公司)提取細菌總 DNA。(2)16S rDNA 的PCR 擴增：以細菌的總 DNA 為模板，采用細菌通用引物(27F，1492R)進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系(30 μL)：PCR反應(yīng)體系為2×TaqPCR Mastermix 25 μL，10 mmol/L 27F引物2 μL，10 mmol/L 1 492R引物2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。(3)PCR反應(yīng)條件為：95℃預變性7 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。將 16S rDNA 序列擴增產(chǎn)物用 2%瓊脂糖凝膠 120V，30 min電泳。(4)擴增產(chǎn)物序列的測定由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。(5)序列比對：基因序列上傳 NCBI，并與GenBank中的序列進行比對，根據(jù)序列同源性確定種屬。利用Clustal×2.0進行相關(guān)序列比對，采用最大簡約法和鄰接法進行分析，分支置信度值通過重采樣1 000次利用MEGA 6.0軟件。繪制 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 細菌的體外生物學特性的分析

1.4.1 耐酸、膽鹽受試實驗

將分離菌株接種MRS液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h后，調(diào)整菌體濃度至108cfu/mL，10 000 r/min 離心10 min收集菌體，無菌條件下接種至pH2.0、pH3.0、pH4.0和pH7.0以及0.1%、0.2%和0.3%豬膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基，37℃恒溫分別培養(yǎng)1、2 h后，進行稀釋，平板計數(shù)，計算活菌數(shù)，以0 h活菌數(shù)為參考。

1.4.2 抑菌實驗

將分離菌株和標準菌株鼠李糖乳桿菌(LGG)活化后接種MRS液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h后，調(diào)整菌體濃度至108cfu/mL，通過10 000 r/min 離心10 min；然后將上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，獲得無細胞上清液(cell-free solution，CFS)；采用牛津杯法測定乳酸菌經(jīng)發(fā)酵得到的無細胞上清液的抑菌能力。選用致病性大腸桿菌CMCCB44102、金黃色葡萄球菌CMCCB50094、銅綠假單胞菌CMCCB10104、乙型副傷寒沙門氏菌CMCCB50094為指示菌。將上述指示菌菌液調(diào)整至107cfu/mL然后吸取100 μL均勻涂布于NB培養(yǎng)基固體平板，待其吸收后，在每個培養(yǎng)基的適當位置用無菌鑷子放置3個直徑6 mm牛津杯，并輕輕按壓牛津杯使其與瓊脂緊密結(jié)合，吸取200 μL分離菌株無細胞上清液分別加至3個牛津杯，立即37℃恒溫培養(yǎng)，于24 h后用游標卡尺分別測量并記錄抑菌圈直徑(抑菌圈直徑為100%抑菌所產(chǎn)生的透明圈環(huán)直徑)。

1.5 藥敏實驗

1.5.1 耐藥基因型的檢測

采用細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取乳酸菌DNA。以乳酸菌的基因組DNA為模板，用設(shè)計合成的26對耐藥基因引物(附表1)，進行PCR擴增。將PCR擴増的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。將瓊脂糖凝膠電泳陽性的PCR擴增產(chǎn)物送往公司進行測序。將測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)上用BLAST軟件在GenBank中進行同源性分析。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)TaqDNA酶 0.3 μL；10×TaqDNA reaction Buffer 2.5 μL；Mg2+2 μL；dNTP 0.5 μL；TaqDNA 上游引物1 μL；下游引物1 μL；模板DNA 1 μL；ddH2O 16.7 μL；PCR反應(yīng)條件：94℃預變性10 min；94℃變性30 s；退火溫度根據(jù)附表1設(shè)定，時間30 s；72℃延伸30 s；循環(huán)數(shù)35次；72℃延伸10 min，4℃保存。

1.5.2 耐藥表型的檢測

采用 K-B 法[15]對分離菌株進行藥敏試驗。所有待檢菌株的藥敏實驗按照“臨床與實驗室標準研究所(CLSI，2009)”的步驟完成。用無菌生理鹽水稀釋待檢菌株的24 h培養(yǎng)物至108cfu/mL，取100 μL均勻涂布于MRS培養(yǎng)基上，選擇36種抗生素藥敏紙片，在每個培養(yǎng)基的適當位置放置抗生素藥敏紙片。37℃培養(yǎng)24 h后測定各藥敏紙片的抑菌圈大小。同時以致病性大腸桿菌作為質(zhì)控菌株。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。將數(shù)據(jù)結(jié)果用 Graphpad Prism 5.2 繪圖軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離、鑒定結(jié)果

從2只幼年大熊貓新鮮糞樣中共篩選出10株菌株命名編號記錄(表1)。所有菌株在MRS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)呈近圓形，乳白色，菌落小，表面濕潤，有光澤，無褶皺中間突起，邊緣整齊；革蘭氏陽性，顯微鏡下呈單個或成對短桿狀。分離菌株特征和乳酸菌一致，是一種兼性厭氧菌，其運動性、過氧化氫酶活性、明膠液化、淀粉水解、枸櫞酸鹽、硫化氫、吲哚、V-P、葡萄糖產(chǎn)氣、尿素、D-核糖和七葉苷反應(yīng)均為陰性；石蕊牛乳產(chǎn)酸、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和甘露醇反應(yīng)均為陽性。

2.2 菌株16S rDNA 擴增與序列分析

分離菌株經(jīng)活化后，然后按照細菌DNA提取試劑盒說明書提取純培養(yǎng)物的DNA，以細菌總DNA為模板所擴增得到的16S rDNA的PCR產(chǎn)物與預期的大小一致，即約為1.5 kb(圖1)。PCR產(chǎn)物回收測序后將各分離菌株測序結(jié)果提交至GenBank上進行16S rDNA比對，根據(jù)GenBank序列同源性比較，10株分離菌株與Lactobacillussalivariusstrain JCM 1231(GenBank登錄號NR-112759.1)同源性98%以上。采用最大似然法構(gòu)建分離菌株的遺傳進化樹(圖1)。

圖1 細菌16S rDNA PCR擴增Fig.1 PCR amplification of 16S rDNA

2.3 耐酸和膽鹽耐受試驗

胃液里含有大量的胃酸，能順利通過胃液到達腸道定殖是益生菌的關(guān)鍵特性。試驗發(fā)現(xiàn)，在較低的pH值2.0環(huán)境，菌株ZM02，ZZ03培養(yǎng)2 h后仍有76.62%、80.75%的存活率，其余菌株生長均受到抑制；膽汁耐受性是菌株在消化道中生長和生存的重要條件。在這個試驗中，在膽鹽濃度為0.3%的條件下菌株ZM02，ZZ03培養(yǎng)2 h有97.76%、99%的存活率。

2.4 菌株上清液抑菌試驗結(jié)果分析

分離菌株上清液對大腸桿菌CMCCB44102、金黃色葡萄球菌CMCCB50094、銅綠假單胞菌CMCCB10104、乙型副傷寒沙門氏菌CMCCB50094均呈現(xiàn)不同的抑制作用，同鼠李糖乳桿菌(LGG)抑菌直徑相比，大腸桿菌抑菌效果最佳為ZM01，其抑菌圈直徑(10.45±0.43)mm；乙型副傷寒沙門氏菌抑菌效果最佳為ZZ03，其抑菌圈直徑(12.58±0.24)mm；銅綠假單胞菌抑菌效果最佳為ZZ04，其抑菌圈直徑(13.99±0.29)mm；金黃色葡萄球菌抑菌效果最佳為ZM06，其抑菌圈直徑(16.85±0.32)mm。具體結(jié)果見圖3。

表1 分離菌株信息Tab.1 Isolation strain information table

2.5 菌株耐藥性實驗結(jié)果

采用 K-B 法對所分離鑒定的唾液乳桿菌株，選擇36種抗生素藥敏紙片的藥敏試驗，結(jié)果顯示10株唾液乳桿菌對36種抗生素耐藥程度不同，對青霉素類(盤尼西林除外)、其他抗生素類的呋喃妥因、亞胺培南和氯霉素類無耐藥菌株出現(xiàn)。對單環(huán)內(nèi)脂類(氨曲南)、磺胺類、硝基咪唑類和多粘菌素類B無敏感菌株。對于其他種類抗生素表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，結(jié)果見表2。

圖2 分離菌株16S rDNA進化樹Fig.2 Lactobacillus 16S rDNA evolutionary tree

圖3 分離菌對大腸桿菌金黃色葡萄球菌(A)、大腸桿菌(B)、銅綠假單胞菌(C)、乙型副傷寒沙門氏菌(D)抑菌實驗結(jié)果Fig.3 Experimental results of bacterial inhibition against Staphylococcus aureus(A)，Escherichia coli(B)，Pseudomonas aeruginosa(C)and Salmonella paratyphi(D)

表2 藥敏實驗結(jié)果Tab.2 Drug sensitivity test results

采用PCR技術(shù)對所有分離鑒定的菌株進行用26對耐藥基因引物擴增菌株獲得相應(yīng)擴增產(chǎn)物，將各凝膠電泳陽性擴增產(chǎn)物的序列測定結(jié)果與GeneBank中的相應(yīng)序列進行比對，結(jié)果表明，26對耐藥基因中的只檢出四環(huán)素耐藥基因(tetM)(檢出率9/10)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，陽性電泳結(jié)果見圖4。

圖4 大熊貓腸道乳酸菌耐藥基因檢測結(jié)果Fig.4 Genetic testing results of intestinal lactic acid bacteria resistance in giant pandas 注：M：D2000 DNA Marker；1-9(tetM)：ZM01，ZM03，ZM04，ZM05，ZM06，ZZ01，ZZ02，ZZ03，ZZ04

3 討論

唾液乳桿菌屬于乳桿菌科(Lactobacillaceae)、乳桿菌屬(Lactobacillus)，廣泛地存在于人和動物的腸道。近年來，唾液乳桿菌作為一種具有極大潛力的益生性乳桿菌，已成為近年研究的熱點唾液乳桿菌并不斷被用來制作成適用于人和動物益生制劑。我國衛(wèi)生部2010年65號公告批準將唾液乳桿菌作為食品生產(chǎn)加工使用的菌種之一[16]。乳桿菌是大熊貓腸道中正常菌群的一部分，其菌群構(gòu)成也會隨著年齡、季節(jié)、食性的轉(zhuǎn)變而發(fā)生改變。研究表明處于食性轉(zhuǎn)變的幼年大熊貓腸道中乳酸菌豐度最高，多樣性也最高[2]。因此，本研究通過采集健康幼年雙胞胎大熊貓的新鮮糞便，進行乳酸菌的篩選工作，最后從兩個樣品中分離鑒定得到10株唾液乳酸桿菌，隨后對分離菌株進行部分的生物學特性及藥敏分析。最后得到1株生物特性好且無耐藥性號的菌株，以期為后續(xù)開發(fā)熊貓源乳酸菌制劑，或?qū)⑼僖喝闂U菌與一種或多種其他益生菌結(jié)合在一起制成復合型菌制劑的研究及應(yīng)用提供廣闊的發(fā)展空間。

定殖在腸道的乳桿菌生長代謝過程中可通過分泌有機酸、細菌素等物質(zhì)抑制其他細菌的生長，并與病原菌競爭生長空間從而發(fā)揮其拮抗作用[17-18]。倪敬軒等[19]通過從健康仔豬新鮮糞便中分離到的唾液乳桿菌對豬源致病性大腸桿菌也表現(xiàn)了極強的致病性。為預防和治療仔豬腹瀉腸道疾病奠定了基礎(chǔ)。腹瀉等腸道疾病是動物養(yǎng)殖中最常見的一種腸道疾病，在大熊貓保護工作中亦是如此[20]。目前對于大熊貓腸道疾病的治療主要是使用抗生素。但近年來由于抗生素的大量使用導致產(chǎn)生致病性耐藥菌株，使其療效越來越差[21-22]。因此，通過開發(fā)和利用益生菌制劑作為抗生素的補充或替代抑制病原菌生長、減少病原菌定植、改善腸道屏障功能、維持腸道共生微生物菌群平衡、增強機體免疫力進而抵御部分胃腸道致病菌的感染就顯得越來越重[23-24]。本研究分離得到的唾液乳桿菌除了菌株ZZ02對乙型副傷寒沙門氏菌沒有抑制效果外，其余都有抑制效應(yīng)，可能是同一種屬的菌株在生物學上特異性引起的。

60年前人們就開始利用抗生素來治療細菌性疾病，隨著大量的新品種抗生素相繼問世，抗生素濫用現(xiàn)象越來越嚴重。導致耐藥性問題也逐漸地顯現(xiàn)出來，使人們在治療與防治感染性疾病時面臨新的考驗。因此，對于篩選新的益生用菌株進行耐藥性的檢測是非常必要的。

大部分乳酸菌對抗革蘭陰性菌(Gram negative bacilli)的抗生素具有耐藥性，例如鏈霉素、慶大霉素和卡那霉素。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)唾液乳桿菌對萬古霉素具有耐藥性[25-26]。本研究通過藥敏實驗和PCR技術(shù)對分離菌株進行檢測，結(jié)果表明：10株唾液乳桿菌對青霉素類、頭孢類、氯霉素類、林克霉素類及其他抗生素類(亞胺培能)不耐受。對單環(huán)內(nèi)脂類、糖肽類、氨基糖苷類、四環(huán)素類和磺胺類的抗生素耐受性高。每種菌株至少對17種抗生素的不耐受。而通過26對耐藥基因檢測，只檢測到四環(huán)素類(tetM)耐藥基因。在這9株含耐藥基因的唾液乳桿菌中，有兩株經(jīng)K-B法藥敏結(jié)果顯示對四環(huán)素高度敏感，可能是由于乳酸菌具有主動或被動的通過接合質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子與其他細菌交換遺傳物質(zhì)的潛在能力，這種潛在的能力是其能夠從其他細菌獲得抗生素耐藥性基因[27-28]，因此，這兩株菌雖含有該耐藥基因但未表達。

綜上所述，本研究通過從2只幼年健康大熊貓的新鮮糞便中篩選乳酸菌株，采用牛津杯法、活菌計數(shù)法和耐受性實驗、藥敏實驗從分離的10株唾液乳桿菌中篩選到一株編號為103的唾液乳桿菌株。該菌株在pH2.0、膽鹽濃度為0.3%的條件下培養(yǎng)2 h有25%、88%的存活率；不含耐藥基因，對臨床腸道疾病常用抗生素敏感。該菌株可為后續(xù)得到熊貓源微生態(tài)制劑提供發(fā)展空間。

附表1 26種耐藥基因PCR引物序列

Attached list.26 drug resistance genes PCR primers

續(xù)附表1