邵氏“五針法”對(duì)哮喘模型大鼠血清α-SMA及FN表達(dá)的影響

李真，邵素菊

(1.許昌市中醫(yī)院，河南 許昌 461000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008)

支氣管哮喘是一種由多種炎癥細(xì)胞、結(jié)構(gòu)細(xì)胞和細(xì)胞組分共同參與的氣道慢性過敏性炎癥疾病[1]。其特點(diǎn)是可逆的氣道阻塞性反應(yīng)、間歇性氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)性。中醫(yī)治療哮喘具有安全經(jīng)濟(jì)、療效確切等特點(diǎn)。

導(dǎo)師邵素菊教授繼承和發(fā)揚(yáng)了其父邵經(jīng)明教授在長(zhǎng)期臨床基礎(chǔ)中總結(jié)出來的治療哮喘的獨(dú)特療法—邵氏“五針法”,療效顯著。在前期進(jìn)行了多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究，但大多集中在哮喘的炎癥機(jī)制方面。氣道重塑是全氣道復(fù)雜改變的復(fù)合體，是哮喘慢性化、持續(xù)化、嚴(yán)重化的重要病理基礎(chǔ)。α-SMA和FN可調(diào)節(jié)氣道平滑肌收縮、遷移及生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)沉積和上皮下纖維化具有重要作用，二者在哮喘氣道重塑過程中起著十分重要的作用。本研究通過對(duì)比針刺前后哮喘模型大鼠血清中α-SMA及FN表達(dá)的變化，觀察邵氏“五針法”改善哮喘氣道重塑的機(jī)制，為針刺治療哮喘提供更加科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供40只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(140±20)g，在河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2 藥物及試劑

卵蛋白(OVA，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)20140107)；地塞米松磷酸鈉注射液(規(guī)格1 mL：5 mg，江蘇連水制藥有限公司，批號(hào)1410112)；0.9%氯化鈉注射液(250 mL/瓶，山東魯抗辰新有限公司，批號(hào)1311144208)；氫氧化鋁干粉(白銀化學(xué)試劑廠，批號(hào)20130916)。α-SMA、FN的ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司提供，批號(hào)20140120B)；4%多聚甲醛(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)20131213)。

1.3 儀器設(shè)備

0.5寸30號(hào)一次性毫針(0.30 mm×15 mm,環(huán)球牌)；超低溫冰箱(SANYO公司)；超聲霧化器(上海福林醫(yī)療設(shè)備有限公司)；電子天平(廣州天平儀器廠)；生物顯微鏡BX41-32P0(日本奧林巴斯)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

先將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為每組10只，即針刺治療組、藥物治療組、空白對(duì)照組和模型對(duì)照組。依據(jù)文獻(xiàn)《肺臟免疫學(xué)及免疫相關(guān)性疾病》[2]方法建立大鼠哮喘模型。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第8天的時(shí)候開始對(duì)大鼠進(jìn)行致敏，除了空白對(duì)照組采用生理鹽水腹腔注射外，其他各組均選取1 mL的10%復(fù)合OVA抗原溶液致敏。從致敏當(dāng)天開始計(jì)算，第15天時(shí)進(jìn)行哮喘激發(fā)，將大鼠放于封閉的霧化箱內(nèi)，每日1次，用霧化器持續(xù)噴入1% OVA溶液(空白對(duì)照組用生理鹽水取代)20 min激發(fā)哮喘，共7次。藥物治療組：從致敏后第15天起，每日在激發(fā)實(shí)驗(yàn)完成后，大鼠腹腔注射0.05%地塞米松磷酸鈉溶液，每日1次，共10次(在7次激發(fā)實(shí)驗(yàn)完成后，繼續(xù)注射給藥3天)。針刺治療組：從致敏后第15天起，選取大鼠“肺俞(雙)”“大椎”“風(fēng)門(雙)”穴，每日于激發(fā)實(shí)驗(yàn)后針刺1次。采用平補(bǔ)平瀉法，留針30 min，每隔10 min行針1次，每日1次，共治療10次(7次激發(fā)實(shí)驗(yàn)完成后，繼續(xù)針刺3天)。模型對(duì)照組適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照上述造模方法進(jìn)行造模?？瞻捉M用生理鹽水代替卵蛋白按照上述方法進(jìn)行。

1.5 標(biāo)本取材

最后一次治療后立即用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.35 mL/100 g)，脫頸椎處死大鼠后取眼球血，離心血清備用。取大鼠肺組織進(jìn)行石蠟包埋，切片待用。

1.6 標(biāo)本處理

切片組織進(jìn)行HE染色，血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠各組肺組織HE染色形態(tài)學(xué)觀察

結(jié)果見圖1～4?？瞻讓?duì)照組：大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，氣道上皮完整、光滑，支氣管管腔規(guī)則，肺間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞，肺泡、肺泡間隔形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。模型對(duì)照組：氣道上皮水腫、脫落，支氣管管腔狹窄、變形，管腔內(nèi)炎癥滲出物增多，黏膜下層和平滑肌層增生，肺間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔明顯增寬。藥物治療組：氣道上皮少量脫落，支氣管管腔形態(tài)基本正常，黏膜下層和平滑肌層輕度增生，肺間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔輕度增寬。針刺治療組：氣道上皮結(jié)構(gòu)基本完整，支氣管管腔基本規(guī)則，黏膜下層和平滑肌層增生不顯著，肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，肺泡及肺泡間隔結(jié)構(gòu)基本正常。

圖1 空白對(duì)照組HE染色圖(10×20)

圖2 模型對(duì)照組HE染色圖(10×20)

圖3 藥物治療組HE染色圖(10×20)

圖4 針刺治療組HE染色圖(10×20)

2.2 血清結(jié)果α-SMA含量的表達(dá)

結(jié)果見表1。針刺治療組、模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，大鼠血清中α-SMA濃度可見增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；藥物治療組、針刺治療組與模型對(duì)照組比較，α-SMA濃度顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但仍然高于空白對(duì)照組；針刺治療組與藥物治療組比較，α-SMA濃度有所下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.01)；四組對(duì)比，F(xiàn)=121.431，P=0.000<0.01。

2.3 血清FN含量的表達(dá)

結(jié)果見表2。針刺治療組、模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，大鼠血清中FN濃度可見增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；藥物治療組、針刺治療組與模型對(duì)照組比較，F(xiàn)N濃度顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但仍然高于空白對(duì)照組；針刺治療組與藥物治療組比較，F(xiàn)N濃度有所下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.01)；四組對(duì)比，F(xiàn)=97.357，P=0.000<0.01。

表1 大鼠各組血清中α-SMA含量的比較

注：與空白對(duì)照組比較，☆P<0.01；與模型對(duì)照組比較，△P<0.01；與藥物治療組比較，▲P<0.01。

表2 大鼠各組血清中FN含量的比較

注：與空白對(duì)照組比較，☆P<0.01；與模型對(duì)照組比較，△P<0.01；與藥物治療組比較，▲P<0.01。

3 討論

哮喘是一種氣道慢性過敏性炎癥疾病，多種炎癥細(xì)胞、結(jié)構(gòu)細(xì)胞和細(xì)胞組分參與其中。既往研究認(rèn)為，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥介質(zhì)的釋放是哮喘發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，氣道重塑作為哮喘慢性化、持續(xù)化、嚴(yán)重化的重要病理基礎(chǔ)，對(duì)哮喘的發(fā)生、發(fā)展具有不可忽視的重要作用[3-4]。氣道重塑可以導(dǎo)致呼氣期為主的通氣功能障礙加重，氣流阻塞的可逆性減小，肺內(nèi)殘氣量增加，從而激發(fā)和加重哮喘的癥狀[5-6]。

哮喘氣道重塑包括全氣道所有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)改變，其主要病理改變不僅只有氣道平滑肌的增生和肥大，還包括上皮下纖維化，管腔狹窄，氣道壁增厚，黏膜肥厚，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，肌成纖維細(xì)胞增生，炎癥的細(xì)胞浸潤(rùn)等[7-8]。這種復(fù)雜的氣道結(jié)構(gòu)重塑會(huì)進(jìn)一步加重氣流受限及氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥，而且還會(huì)加速肺功能的損害。

α-SMA是平滑肌細(xì)胞的特征性標(biāo)記物，同時(shí)也是氣道最主要的結(jié)構(gòu)及收縮蛋白，可以調(diào)節(jié)氣道平滑肌細(xì)胞的收縮、遷移和生長(zhǎng)[9]。FN可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、分化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積及上皮下纖維化[10]，參與了哮喘氣道炎癥損傷的修復(fù)和應(yīng)激反應(yīng)。二者均在哮喘的氣道結(jié)構(gòu)重塑過程中起重大作用。本研究通過觀察針刺前后哮喘模型大鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變及血清中α-SMA和FN表達(dá)的變化，探討邵氏“五針法”對(duì)哮喘氣道重塑的作用途徑，以及針刺治療哮喘的作用機(jī)制。結(jié)果藥物治療組及針刺治療組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本完整，支氣管管腔及氣道基本規(guī)則，肺泡及肺泡間隔結(jié)構(gòu)基本正常，肺間質(zhì)炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞較少。說明藥物或針刺治療均能有效改善哮喘大鼠肺組織的炎癥浸潤(rùn)及其對(duì)肺組織結(jié)構(gòu)的破壞，但與空白對(duì)照組對(duì)比，仍存在炎癥及氣道和肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞的病理表現(xiàn)，兩種治療方法治療哮喘療效肯定，但均未達(dá)到治愈的水平。邵氏“五針法”能明顯降低哮喘模型血清中α-SMA及FN的陽性表達(dá)，改善氣道重塑及氣道炎癥，這可能是邵氏“五針法”治療哮喘的作用機(jī)制之一。