復方雙參顆粒中人參皂苷含量測定

姜麗萍,侯會芳，王振波，李桂榮,尚金燕，姜志輝*，黃建軍*

（1.天參密碼藥業(yè)股份有限公司，威海264211；2.山東藥品食品職業(yè)學院，威海264210；3.山東大學（威海）海洋學院，威海264209）

人參來源于五加科人參屬植物人參Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根，主產于我國東北，尤以吉林省產量最大，質量最佳，是我國傳統(tǒng)的珍貴藥材。人參大補元氣，復脈固脫，補脾益肺，生津養(yǎng)血，安神益智。根據(jù)加工方法不同，分為鮮人參、生曬參、紅參等產品。人參是百草之王，紅參是人參的熟用品，具有大補元氣，復脈固脫，益氣攝血功效。紅參的加工方法是用人參經過浸潤、清洗、分選、蒸制、烘干等工序加工而成。紅參在蒸制過程中，因為熱處理會發(fā)生化學反應，成份上發(fā)生變化，生成紅參特有的生理活性物質，例如人參皂苷-Rg3、Rh2等抗癌活性成分，具有抑制癌細胞增長的作用。在補虛方面紅參強于白參，久服紅參可以補氣、益血、生津、強心、補脾健胃、益肺、提高人體免疫力、抗氧化、抗疲勞、抗衰老、抗輻射、抑制腫瘤、調整人體內分泌系統(tǒng)。在癌癥手術后,紅參還能夠減輕放化療后產生的許多毒副作用。

海參屬于海參綱（Holothuroidea），是生活在海邊至8000米的海洋棘皮動物，距今已有6億多年的歷史，海參以海底藻類和浮游生物為食。海參全身長滿肉刺，廣布于世界各海洋中。中國南海沿岸種類較多，約有二十余種海參可供食用。海參同人參、燕窩、魚翅齊名，是世界八大珍品之一。海參不僅是珍貴的食品，也是名貴的藥材。據(jù)《本草綱目拾遺》中記載：海參，味甘咸，補腎，益精髓，攝小便，壯陽療痿，其性溫補，足敵人參，故名海參。海參具有提高記憶力、延緩性腺衰老，防止動脈硬化以及抗腫瘤等作用。

將人參、海參等以營養(yǎng)學和中醫(yī)藥學為基礎，通過現(xiàn)代科學技術研發(fā)具有改善記憶、預防老年癡呆、抗衰老等營養(yǎng)保健作用的雙參顆粒功能食品。由于人參皂苷是人參的標志性成分，也是主要活性成分，所以雙參顆粒以人參皂苷含量作為其質量標準之一。

目前有許多檢測人參皂苷的方法。本文采用藥典方法、國家農業(yè)行業(yè)標準NY/T1842-2010，《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范手冊》2003版檢驗方法和紅參分等質量GB/T 22538-2018檢驗方法測定樣品中人參皂苷-Rg1、人參皂苷-Re、人參皂苷-Rb1和總皂苷含量，以比較4種檢驗方法測定人參皂苷含量的高低，為食品、保健食品和藥品企業(yè)含有人參的產品制定企業(yè)標準提供參考數(shù)據(jù)[1～13]。

1 實驗材料、儀器與試劑

1.1 實驗材料

天參密碼高麗紅參（將進口韓國高麗鮮人參，采用韓國紅參加工工藝和中國紅參加工技術相結合制備而成），配伍威海產海參、昆布、核桃、黑豆、黑芝麻、燕麥、胡蘿卜、無花果、大棗、適量麥芽糊精通過現(xiàn)代科學技術研發(fā)制備為雙參顆粒。

1.2 儀器

UltiMate3000高效液相色譜儀，包括：四元泵，在線脫氣機，柱溫箱，UV檢測器，化學工作站（Chromeleon TM變色龍工作站）；UV-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；索氏提取器。

1.3 試劑

乙腈（美國Fisher公司，色譜純），其他試劑為分析純。人參皂苷對照品人參皂苷-Rg1，批號：110703-201529，純度：95.0%、人參皂苷-Re，批號：110754-201525，純度：92.3%、人參皂苷-Rb1，批號：110704-201424純度為93.7% (購于中國食品藥品檢定研究院)、D-101大孔吸附樹脂；3cmAmberlite-XAD-2大孔樹脂、中性氧化鋁，乙醇、甲醇、正丁醇、香草醛-冰乙酸溶液、高氯酸、冰乙酸、硫酸、乙醚（均為分析純）。

2 方法

2.1 藥典方法

2.1.1 人參皂苷-Rg1、人參皂苷-Re、人參皂苷-Rb1的含量測定（按照高效液相色譜法測定）

2.1.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按下表中的 規(guī)定進行梯度洗脫；檢測波長為203nm。理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計算應不低于6000。

時間（min） 流動相A（%） 流動相B（%）0～35 19 81 35～55 19→29 81→71 55～70 29 71 70～100 29→40 71→60

2.1.1.2 對照品溶液的制備

分別取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rb1對照品，加甲醇制成每1mL中含人參皂苷Rg1 0.5mg、人參皂苷Re 0.3mg、人參皂苷Rb1 0.5mg的混合溶液，即得。

2.1.1.3 供試品溶液的制備

取本品粉末約1g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷適量，加熱回流3h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒移入具塞錐形瓶中，精密加入水飽和正丁醇50mL，密塞，放置過夜，超聲處理 （功率250W，頻率50kHz）30min，濾過。精密量取續(xù)濾液25mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.1.4 方法學考察

a.線性關系的考察

吸取上述對照品溶液，分別進樣 2、4、8、10、12μL，按上述色譜條件進行HPLC分析，以峰面積和進樣質量進行線性回歸，人參皂苷Rb1線性方程為Y=603105 X+74303.3（R=0.9989，n=5），人參皂苷 Rg1 線性方程為 Y=681792 X+47625.1（R=0.9991，n=5），人參皂苷Re線性方程為Y=821967X+27568.0（R=0.9993，n=5），結果表明人參皂苷Rb1在2～12μg與峰面積具有良好的線性關系，人參皂苷Rg1在2～12μg與峰面積具有良好的線性關系，人參皂苷Re在2～12μg與峰面積具有良好的線性關系。

b.精密度實驗的考察

精密吸取人參皂苷 Rb1、Rg1、Re對照品溶液(1.0mg/mL)10μL,重復進樣5次,測定人參皂苷Rb1、Rg1、Re峰面積,得其 RSD分別為 1.06%、1.14%、1.25%。實驗結果表明，實驗設備具有良好的精密度

c.穩(wěn)定性實驗的考察

取雙參顆粒樣品，按上述制備方法制備供試品溶液，進樣10μL,每隔2h測定1次，樣品中人參皂苷Rb1、Rg1、Re峰面積的 RSD 分別為 1.48%、1.67%、1.13%(n=5)。實驗結果表明,樣品在8h內穩(wěn)定。

d.重現(xiàn)性實驗

取雙參顆粒樣品,按上述制備方法，重復制備5份供試品溶液，分別測定,結果中人參皂苷Rb1、Rg1、Re質量分數(shù)的RSD分別為1.85%、1.48%、1.42%。實驗結果表明，該實驗方法重現(xiàn)性良好。

e.回收率實驗

采取加樣回收法。精密稱取5份雙參顆粒樣品2.000g,分別加入一定量的人參皂苷Rb1、Rg1、Re對照品，制備供試品溶液，進行測定，計算得人參皂苷Rb1、Rg1、Re平均回收率分別為 100.17%、99.06%和98.65%，RSD分別為1.53%、1.81%和1.36%(n=5),表明結果準確可靠。

2.1.1.5 樣品測定 取3批雙參顆粒樣品，按上述方法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液10μL與供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，在上述選定的色譜條件下進行分析，將其峰面積代入相應的回歸方程，并計算 Rb1、Rg1、Re的含量。

2.2 中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準（NY/T 1842-2010）方法

2.2.1 人參皂苷-Rg1、人參皂苷-Re、人參皂苷-Rb1的含量測定

2.2.1.1 對照品溶液的制備

準確稱取 Rg10.163 g、Re 0.183 g、Rb10.255 g(精確至0.0001 g)人參皂苷對照品,置于100 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成質量濃度為 1.6、1.8、2.5 g/L的混合標準溶液,貯存在-18℃以下冰箱中,有效期6個月。

2.2.1.2 供試品溶液的制備

準確稱取樣品2 g(精確至 0.001 g),加入100 mL乙醚于索氏提取器中,提取1 h，棄去乙醚,待殘渣中乙醚揮干后,再加入甲醇回餾8 h?；亓骱筇崛∫涸?0°C水浴條件下，經旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至近干,氮氣吹干,加入4 mL去離子水充分搖勻。

2.2.1.3 SPE C18柱的預處理

先用20 mL去離子水淋洗，然后用20 mL的甲醇對SPE C18柱進行活化，再用20 mL去離子水平衡。待水與柱篩板近平時上樣。取2 mL注入預先活化好的SPE C18柱中，待液面與柱篩板近平時，倒人10 mL去離子水淋洗SPE C18柱，棄去流出液，待淋洗液液面與柱篩板近平時，加入25 mL乙醇溶液(70%)洗脫SPE C18柱，收集洗脫液于50 mL刻度試管中，氮氣吹至25 mL以下，用甲醇定容至25 mL，混勻后，用 0.2 μm濾膜過濾，待測。

2.2.1.4 測定

a.儀器參考條件

色譜柱：C18(4.6mm X 300mm X 0.5 μm)，流動相：甲醇十水，柱溫：47℃，流速：0.8 mL/min檢測波長：202nm，進樣量：10μL，梯度洗脫程序見表 1。

表1 梯度洗脫程序

b.標準曲線的繪制

用混合單體人參皂苷標準工作液按著梯度洗脫程序進行分析。 準確吸取 0、2、4、6、8、10 mL 混合單體人參皂苷標準溶液,分別置于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,準確吸取10μL各容量瓶中的標準溶液,分別注入液相色譜儀,記錄峰面積。以各人參皂苷進樣的質量濃度對其峰面積繪制標準曲線。

c.樣品測定

準確吸取10μL供試樣品溶液注人液相色譜儀,以保留時間定性,以待測液峰面積與標準溶液峰面積比較定量。

d.空白實驗

不加試樣,采用與試樣完全相同的測定步驟進行平行操作。

2.2.1.4 結果計算 試樣中人參皂苷的含量用質量分數(shù)ω表示,單位為(%),按下列公式計算：

式中：

m1一試樣中某種人參皂苷的含量,單位為毫克(mg);

m2-一試樣稱樣的質量,單位為克(g);

V1-一試樣的進樣體積,單位為毫升(mL);

V2一試樣的定容體積,單位為毫升(mL)。

2.3 《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范手冊》2003版方法

2.3.1 人參皂苷-Rg1、人參皂苷-Re、人參皂苷-Rb1的含量測定

2.3.1.1 液相條件

色譜柱：反相 C18柱，4.6×250mm，5μm； 紫外檢測器：檢測波長203；柱溫：35℃。梯度洗脫條件，詳見表2。

表2 梯度洗脫條件

2.3.1.2 樣品制備

將樣品研成粉末，過20目篩，精確稱取該粉末適量于50mL容量瓶中，加水50mL于超聲波清洗器中提取30min，取出，待溶液恢復常溫后，定容至50mL。再準確量取10mL，通過D-101大孔吸附樹脂凈化柱（大孔吸附樹脂使用前先用甲醇浸泡，水洗，裝成10cm長小柱），小柱先用10mL水沖洗，棄去水液之后，用70%甲醇50mL洗脫皂苷，收集甲醇溶液，水浴上蒸干，殘渣以甲醇溶解并定容至5mL，該樣液離心后過0.2μm的濾膜，濾液進行色譜分析。

2.3.1.3 試樣測定

a.標準曲線的制備

將混合標準系列溶液均取10μL進液相分析，用峰面積對濃度作各人參皂苷的標準回歸曲線。b.試樣的測定

取10μL試樣凈化液進高效液相色譜儀，以絕對保留時間定性，用峰面積通過各人參皂苷標準曲線定量計算試樣中人參皂苷-Rg1、人參皂苷-Re、人參皂苷-Rb1的含量。

2.3.1.4 計算：

C—試樣溶液中各人參皂苷的含量，mg/mL

M—試樣的稱樣量，g。

2.3.1.5 方法學考察

a.線性關系

精密稱取以60℃減壓干燥10h的人參皂苷-Rg1 10mg，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容。使對照品溶液（母液）的濃度約為1mg/mL。然后分別吸取50μL、100μL、200μL、400μL、800μL、1.6mL、3.2mL 對照品溶液（母液）分別置于各個10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制備成不同濃度的對照品溶液，分別精密吸取不同濃度的對照品溶液各20μL進樣。以色譜峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，經統(tǒng)計學計算得直線回歸方程，回歸方程為：Y=33.5042+501.2928X，r=0.9997

b.穩(wěn)定性實驗

取人參皂苷-Rg1的對照品溶液，精密吸取20μL，按上述色譜條件，分別于0、2、4、8h檢測，峰面積RSD為1.98%。

c.精密度實驗

取人參皂苷-Rg1的對照品溶液，精密吸取20μL，按上述色譜條件進樣分析，連續(xù)5次，測定峰面積，其RSD為1.92%。

d.重現(xiàn)性實驗

取同一粉碎后的紅參樣品5份，分別處理后，分別精密吸取20μL按上述色譜條件測定，峰面積RSD為2.66%。

e.回收率實驗

采用加樣回收法，取已知含量的紅參粉末2g，精密稱定，分別準確加入一定量的人參皂苷對照品，按上述色譜條件測定，平均回收率為99.85%，RSD為3.28%。

2.3.2 人參總皂苷含量測定

2.3.2.1 人參總皂苷的含量測定

a.樣品制備

將樣品研成粉末，精確稱取該粉末適量于100mL容量瓶中，加水60mL于超聲波清洗器中提取30min，取出，待溶液恢復常溫后，定容至100mL，準確量取1mL，進行柱層析。

b.柱層析

用10mL注射器作層析管，內裝3cmAmberlite-XAD-2大孔樹脂，上加1cm中性氧化鋁。先用25mL70%乙醇洗柱，棄去洗脫液，再用25mL水洗柱，棄去洗脫液，精確加入1.0mL已處理好的試樣溶液。用25mL水洗柱，棄去洗脫液，用25mL70%乙醇洗脫人參皂苷，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中，置于60度水浴揮干，顯色用。

c.顯色

在上述已揮干的蒸發(fā)皿中準確加入0.2mL5%香草醛冰乙酸溶液，轉動蒸發(fā)皿，使殘渣都溶解，再加0.8mL高氯酸，混勻后轉入5mL帶塞刻度離心管中，60度水浴上加熱10min，取出，冰浴冷卻后，準確加入冰乙酸5.0mL，搖勻后，以1cm比色池于560nm波長處與標準管一起進行比色測定。

d.標準管

吸取人參皂苷Re標準溶液 （2.0mg/mL）100μL放蒸發(fā)皿中，置水浴揮干（低于60℃）或熱風吹干 ，再同樣品“柱層析 ”操作。

e.計算

X-試樣中總皂苷量（以人參皂苷Re計），g/100g

A1—樣品吸光度值

A2—標準液吸光度值

C—標準管人參皂苷Re的量，μg

V—試樣的稀釋體積，mL

m-樣品的稱樣量，g

2.4 人參總皂苷含量測定（紅參分等質量GB/T 22538-2018）方法

2.4.1 原理

樣品用乙醚脫脂后，用甲醇回流提取后再用水飽和的正丁醇超聲萃取純化皂苷，人參皂苷可以與硫酸-香草醛顯色，在544nm波長處有最大吸收峰，在一定濃度下符合朗伯-比爾定律。

2.4.2 分析步驟

2.4.2.1 供試品溶液的制備

取供試品約1g，精密稱定，用中性濾紙包好，置于索氏提取器中，加入乙醚，微沸回流提取1h，棄去乙醚液，供試品藥包揮干乙醚溶劑，再置于另一索氏提取器中加入甲醇浸泡過夜，次日再加入適量甲醇開始微沸回流提取，回流6次，以人參皂苷提盡為準（定性鑒別陰性）。合并甲醇提取液，回收甲醇，少量提取液置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干。用蒸餾水溶解提取物，加水30～40ml至分液漏斗中用水飽和正丁醇30ml進行萃取，共4次。取上層液蒸干，加甲醇溶解后，轉移至10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

人參皂苷提取定性鑒別：供試品回流提取6次以后，取少量點于硅膠G薄層板（105℃活化10min）上，用10%硫酸乙醇溶液顯色，即將薄層板置于通風櫥內，噴10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱10min，總皂苷陽性應為紫紅色斑點。也可將薄層板置于碘氣缸中數(shù)秒鐘即取出，以沒有紫黃色斑點為陰性。判斷人參皂苷是否提取完全，應以索氏提取器中載供試品瓶中的溶液定性鑒別為陰性為準。

2.4.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Re對照品10mg，置于10ml量瓶中，加甲醇適量使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.2.3 標準曲線的制作

精密 吸取 人 參 皂 苷 Re 對照 品 10、20、30、40、60μL，置于磨口帶塞試管中，水浴蒸干甲醇后，加入8%香草醛乙醇試液0.5ml、72%硫酸溶液5ml，充分振搖混勻后置于60℃恒溫水浴上加熱10min，立即用冰水冷卻10min，搖勻。以試劑作空白，按照分光光度法于544nm波長處分別測定吸光度，繪制濃度吸收曲線，做回歸方程：［CONC］=a×abs+b

2.4.3 測定

精密吸取供試品溶液20μL，置于具塞刻度試管中，水浴蒸干甲醇后，加入8%香草醛乙醇試液0.5ml、72%硫酸溶液5ml，充分振搖混勻后置于60℃恒溫水浴上加熱10min，立即用冰水冷卻10min，搖勻。以試劑作空白，按照分光光度法于544nm波長處分別測定吸光度。

2.4.4 分析結果計算

以質量分數(shù)（%）表示紅參中人參總皂苷含量（X）按下式計算

式中：

［CONC］—曲線上讀出樣品含量，單位ug；

V1——定容體積，單位為毫升（ml）

V2——取樣體積，單位為微升（μl）

m——供試品稱樣量，單位為毫克（mg）

3 結果

詳見表3。

表3 不同方法測定雙參顆粒中人參皂苷含量的對比（mg/g）

備注：

1藥典方法（公司化驗室檢測）

2農業(yè)行業(yè)標準（公司化驗室檢測，未過SPE C18柱）

3農業(yè)行業(yè)標準（公司化驗室檢測，過SPE C18柱）

4保健食品方法（公司化驗室檢測）

5 GB/T 22538-2018單體皂苷檢測方法與藥典方法相同（公司化驗室檢測）

6 Rg1-人參皂苷，Re-人參皂苷，Rb1-人參皂苷

4 討論

以含有人參的雙參顆粒產品制定標準需要以單體人參皂苷-Rg1，人參皂苷-Re，人參皂苷-Rb1含量作為檢測指標。由于雙參顆粒含有大量的蛋白質、脂肪等干擾成分，采用常規(guī)方法難以將紅參中的有效成分提取分離，因此本實驗研究了多種供試品溶液的制備方法。我們通過實驗數(shù)據(jù)認為：藥典方法最佳，能夠將人參皂苷從樣品中提取分離出來，檢測結果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，能夠有效控制產品質量。也可選用中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準（NY/T1842-2010），該兩種方法均有利于企業(yè)產品質量標準達標。農業(yè)行業(yè)標準中的方法檢測結果與藥典方法差別不大，但樣品的前處理相比藥典較為復雜，且操作中的過SPE C18柱過程繁瑣耗時長，對柱的性能要求較高，才能保證較高的穩(wěn)定的回收率，使結果的重現(xiàn)性達到要求，不如藥典法重現(xiàn)性好且易于操作。保健食品方法檢測單體皂苷由于用水做溶劑，對以人（紅）參或人（紅）參提取物為主要原料的保健食品，如紅參茶、紅參沖劑中的人參皂苷提取效果很好。