近親婚配后代卵巢早衰姐妹的致病基因研究

賀桑，劉佶，彭婀娜，譚小軍，何方，毛卓，許鵬，黃向紅

(湖南湘潭市中心醫(yī)院，湘潭 411000)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)指女性青春期發(fā)育后，于40歲前出現(xiàn)閉經(jīng)、卵巢體積縮小、體內(nèi)雌激素水平下降、促性腺激素水平達到絕經(jīng)后水平的現(xiàn)象。引起該病的病因很多，包括遺傳、環(huán)境、手術(shù)、接觸有害物質(zhì)等[1]，在婦產(chǎn)科中屬于較為常見的內(nèi)分泌疾病[2]，其中約80%患者病因不明[3-5]，稱為特發(fā)性卵巢早衰。卵巢早衰患者早期可表現(xiàn)為月經(jīng)不規(guī)律或月經(jīng)稀發(fā)，繼而發(fā)生持續(xù)性閉經(jīng)[6]，其發(fā)病近年來有年輕化趨勢[7]。我們針對一對同時患有卵巢早衰的親生姐妹的病例資料進行研究分析，旨在探究該家系特發(fā)性卵巢早衰的致病原因。

一、資料與方法

1.研究對象：本次調(diào)查由湘潭市中心醫(yī)院生殖與遺傳中心于2009～2011年完成。該家系的分子遺傳學(xué)研究得到湘潭市中心醫(yī)院倫理委員會的論證認(rèn)可和全體家系成員的知情同意?；颊邚堺惡蛷埼?均為化名)為非孿生親生姐妹。其父母為近親婚配，為姑表親(張麗、張文的爺爺與外婆為親兄妹)，共生育2女1子，女性后代均診斷卵巢早衰(圖1)；其子23歲，尚未結(jié)婚。

對家系中患者及父母雙親進行病史采集和全身體格檢查，并抽取外周靜脈血5～10 ml，提取DNA，-20 ℃保存以備后續(xù)實驗。

圖1 卵巢早衰患者家系圖譜

2.全外顯子測序分析：全外顯子測序由深圳華大基因科技有限公司進行，應(yīng)用NimbleGen SeqCap EZ Exome(44 M)捕獲平臺進行外顯子捕獲測序，獲得的DNA片段用Illumina高通量測序技術(shù)測序，每個樣本的有效平均測序深度達到×50。4份樣本測序結(jié)果覆蓋了幾乎所有外顯子，測序數(shù)據(jù)量18 698 Mb，有效評價覆蓋深度平均值為61.54，目標(biāo)區(qū)域覆蓋大于4×的比例為97.8%。

3.基因分析、Sanger測序驗證及致病性分析：后期經(jīng)過排除內(nèi)含子突變、非移碼突變或缺失以及基因互作分析，并經(jīng)Sanger測序進一步驗證[8]；篩選出可能致病位點；根據(jù)生物信息軟件(SIFT、Polyphen2、Condel)對可能致病位點進行致病性分析。

二、結(jié)果

1.卵巢早衰姐妹臨床資料：(1)妹妹，31歲，身高167 cm，體重60 kg，因“反復(fù)閉經(jīng)12年”于2009年5月湘潭市中心醫(yī)院生殖與遺傳中心就診。查性激素：卵泡刺激素 79.2 U/L、黃體生成素 67.3 U/L、雌二醇 44.04 pmol/L；婦科彩超提示：子宮未見異常，雙側(cè)卵巢體積小，雙側(cè)竇卵泡數(shù)(AFC)實性；體查：乳房發(fā)育正常，外陰女型，陰毛稀疏，色淺，子宮前位，大小質(zhì)地活動正常，雙側(cè)附件未捫及異常。染色體核型分析：46，XX(圖2A)。(2)姐姐，34歲，身高157 cm，體重48 kg，因“婚后11年，月經(jīng)紊亂10年，閉經(jīng)8年”于2010年6月湘潭市中心醫(yī)院生殖與遺傳中心就診。查性激素：卵泡刺激素 102.6 U/L、黃體生成素 121.5 U/L、雌二醇 47.71 pmol/L；婦科彩超提示：子宮未見異常，雙側(cè)卵巢體積小，雙側(cè)AFC實性；體查：乳房偏小，外陰女型，陰毛稀疏，顏色正常，子宮前位，大小質(zhì)地活動正常，雙側(cè)附件未捫及異常。染色體核型分析：46，XX，16qh+(圖2B)。

A：妹妹核型；B：姐姐核型(箭頭示16qh+)圖2 卵巢早衰姐妹染色體核型分析

2.全外顯子測序分析：由于家系成員過少，無法預(yù)先判斷疾病的遺傳方式，因此全外顯子測序之后，我們采取假設(shè)驗證的方式分析。由于患者父母并未發(fā)病，可排除常染色體顯性遺傳、X連鎖顯性遺傳和Y染色體遺傳的可能。根據(jù)孟德爾遺傳定律，該家系可能有2種遺傳方式：常染色體隱性遺傳病和X連鎖隱性遺傳病。經(jīng)過生物信息分析，利用在線數(shù)據(jù)庫(千人基因、ESP 數(shù)據(jù)庫)對測序數(shù)據(jù)進行篩選。在假設(shè)X連鎖隱性遺傳的情況下，沒有篩選到符合條件的 SNV 位點，所以最終確定遺傳方式為常染色體隱性遺傳。經(jīng)過全外顯子測序后，初步篩選得到12個突變基因(16個位點)(表1)。

3.基因分析及sanger測序驗證：后期經(jīng)過排除內(nèi)含子突變、非移碼突變或缺失以及基因互作分析，并經(jīng)sanger測序進一步驗證，最后篩選出2個可能致病位點：分別位于基因 AHDC1和PTPN14上。結(jié)合Sanger測序方法對家系內(nèi)成員進行共分離驗證，發(fā)現(xiàn)基因 AHDC1 c.C874T和PTPN14 c.G3344A與表型共分離。

4.致病性分析：根據(jù)生物信息軟件(SIFT、Polyphen2、Condel)對AHDC1和PTPN14基因突變位點進行致病性分析。SIFT軟件分析發(fā)現(xiàn)ADHC1 c.C874T和PTPN14 c.G3344A的值為0.01和0.02(<0.05說明有害突變)。PolyPhen2和Condel軟件分析值越高，表示致病性可能較大，而這兩個突變位點分析值都接近1(表2)。

三、討論

本研究中，兩位姐妹因父母為姑表親近親結(jié)婚，通過外顯子測序發(fā)現(xiàn)基因AHDC1(AT hook DNA binding containing 1，AT鉤DNA結(jié)合蛋白1)和PTPN14(tyrosine-protein phosphatase non-receptor type14，蛋白酪氨酸磷酸酶14)可能為兩位姐妹發(fā)生卵巢早衰的致病基因。由此推測，其父母雙親可能攜帶其中一個致病基因，由于只攜帶一個致病基因，所以并沒有導(dǎo)致疾病的發(fā)生，故父母雙親均無致病的表現(xiàn)。而近親婚配時，各自攜帶的單獨的致病基因均遺傳給子代，使子代致病。

表1 初篩12個突變基因(16個位點)

表2 SIFT、Polyphen2、Condel軟件預(yù)測致病性結(jié)果

既往文獻報道，基因AHDC1與食管癌的發(fā)生有關(guān)，含有AT鉤DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白可以影響染色體的結(jié)構(gòu)并可調(diào)控AT富含區(qū)基因的轉(zhuǎn)錄[9-10]。此外，其他文獻報道，AHDC1基因新發(fā)剪切突變導(dǎo)致蛋白編碼提前終止，致使患者出現(xiàn)精神、運動、語言發(fā)育緩慢，肌張力低下，腦發(fā)育不良等[11]。PTPN14是蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶超家族的成員，與多種細(xì)胞過程密切相關(guān)，比如細(xì)胞生長、分化、腫瘤發(fā)生等過程，文獻報道與乳腺癌、食管癌、膽管癌的發(fā)病有關(guān)。這兩個基因都是多細(xì)胞、多信號通路調(diào)控的相關(guān)基因，目前雖然尚無研究證實AHDC1和PTPN14與卵巢相關(guān)疾病有關(guān)，但是由于卵巢早衰本身機制復(fù)雜，是否AHDC1和PTPN14在某個信號通路調(diào)控過程中發(fā)生了改變并最終導(dǎo)致卵巢早衰，還需要進一步的深入研究。同時，也不能排除遺傳過程中新發(fā)突變導(dǎo)致的疾病。

本研究通過全外顯子測序分析該家系成員4名，發(fā)現(xiàn)基因AHDC1和PTPN14可能為該家系特發(fā)性卵巢早衰的致病基因。目前尚無文獻報道基因 AHDC1 和PTPN14是否與卵巢早衰發(fā)病相關(guān)，并且上述實驗僅針對單個家系進行基因測序。我中心將繼續(xù)通過擴大樣本，同時開展動物實驗及基因敲除技術(shù)來進一步研究卵巢早衰與上述基因的相關(guān)性，以期為特發(fā)性卵巢早衰提供新的研究靶點。