mTOR-自噬通路對膿毒癥小鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響

莊欣琪，蔣毅，楊曼，王瑤琪，盧悅淳，呂國義，謝克亮，于泳浩△

膿毒癥是一種全身炎癥反應(yīng)綜合征，主要由感染因素誘發(fā)，以炎癥系統(tǒng)的過度激活為主要病理特征，是機(jī)體和病原體相互作用引起的抗炎和促炎反應(yīng)失衡的結(jié)果［1-2］。膿毒癥患者常出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能異常，包括注意力、學(xué)習(xí)和記憶能力降低等［3-4］。膿毒癥腦功能障礙的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚不明確，研究表明，膿毒癥可引起海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化，在膿毒癥腦功能障礙的病理生理過程中起重要作用［5］。小膠質(zhì)細(xì)胞活化后存在兩種表型：M1表型主要分泌多種促炎因子，介導(dǎo)炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展；M2表型主要分泌抗炎因子，抑制炎癥反應(yīng)的過度發(fā)生，促進(jìn)組織修復(fù)［6-7］。有研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）-自噬通路可調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，是中樞炎性反應(yīng)的潛在治療靶點［8］。本研究擬探討mTOR-自噬通路對膿毒癥小鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響，為研究膿毒癥腦病的機(jī)制和治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 主要試劑與儀器 主要試劑：mTOR抑制劑雷帕霉素（Ra）購自美國Sigma公司；抗CD86、抗CD206、抗離子鈣接頭蛋白分子（Iba）-1、抗p-mTOR、抗Beclin-1、抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ（LC3Ⅱ）一抗購自英國Abcam公司；抗β-actin一抗購自美國Sigma公司；山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；熒光標(biāo)記驢抗兔和驢抗大鼠二抗購自美國Jackson公司；腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10及轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購于美國R&D公司。BX53F熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；EnSpire酶標(biāo)儀購自美國PerkinElmer公司；PowerPac 200電泳儀和Mini-PROTEAN Tetra電泳槽購自美國Bio-Rad公司。

1.1.2 實驗動物與分組 成年雄性ICR小鼠54只，6～8周齡，體質(zhì)量20～30 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心，許可證號SCXK-（軍）2014-0001。將動物常規(guī)喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字法分為3組：假手術(shù)組（Sham組）、膿毒癥組（CLP組）和膿毒癥+mTOR抑制劑雷帕霉素組（CLP+Ra組），每組18只。

1.2 方法

1.2.1 膿毒癥模型的制備 參照文獻(xiàn)［9-10］采用盲腸結(jié)扎穿孔法（CLP法）建立小鼠膿毒癥模型。腹腔注射2%水合氯醛（15 mL/kg）麻醉，腹部備皮消毒后，沿腹中線切開皮膚、腹壁約1 cm，以無菌無齒鑷探查至盲腸，于回盲瓣下方盲腸近段1/4處用手術(shù)縫線結(jié)扎盲腸，用20 G無菌針頭分別于結(jié)扎盲腸頭尾端穿孔，并擠出腸內(nèi)容物約0.3 mL，將盲腸和擠出內(nèi)容物一起還納腹腔，取無菌手術(shù)線逐層縫合切口。Sham組僅進(jìn)行開腹及盲腸游離，不進(jìn)行盲腸結(jié)扎及穿孔。術(shù)后頸部皮下注射生理鹽水0.05 mL/g復(fù)蘇。CLP+Ra組參照文獻(xiàn)［11］于造模前6 h腹腔注射雷帕霉素1.5 mg/kg，Sham組和CLP組腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 免疫熒光染色法檢測海馬組織切片Iba-1/CD86和Iba-1/CD206陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量 于CLP后24 h，各組取6只小鼠，深麻醉下處死，左心室灌注等滲生理鹽水，至右心耳流出清亮液體，斷頭取腦，4%多聚甲醛固定，20%及30%蔗糖溶液梯度脫水，用切片機(jī)行冠狀面冰凍切片，切片厚度10μm。隨后經(jīng)PBS沖洗，微波抗原修復(fù)，血清封閉，滴加Iba-1一抗（稀釋度為1∶500），4℃孵育過夜。復(fù)溫后經(jīng)PBS沖洗，滴加熒光（R-PE）標(biāo)記的驢抗兔二抗（稀釋度為1∶1 000）避光孵育1 h，PBS沖洗，滴加CD86或CD206一抗（稀釋度均為1∶500），4℃孵育過夜。復(fù)溫后經(jīng)PBS沖洗，滴加熒光（FITC）標(biāo)記的驢抗大鼠二抗（稀釋度均為1∶1 000）避光孵育1 h，后用含DAPI的防熒光淬滅劑封片，100倍熒光顯微鏡下以海馬齒狀回作為觀察區(qū)域，Iba-1/CD86雙陽性為M1型小膠質(zhì)細(xì)胞，Iba-1/CD206雙陽性為M2型小膠質(zhì)細(xì)胞，計數(shù)M1和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量。

1.2.3 ELISA法檢測海馬TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β水平 于CLP后24 h，各組取6只小鼠，處死及心室灌注方法同前，斷頭取腦，剝離海馬組織，加入預(yù)冷的組織蛋白裂解液勻漿，4℃下15 000 r/min離心10 min后取上清，按照ELISA試劑盒說明書使用酶標(biāo)分析儀測定海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β含量。

1.2.4 蛋白免疫印跡技術(shù)（Western blot）檢測海馬p-mTOR、LC3Ⅱ和Beclin-1表達(dá) 于CLP后24 h，各組取6只小鼠，剝離海馬取勻漿上清方法同前，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量分析，每孔取20μg蛋白上樣，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），采用濕式電轉(zhuǎn)移法將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗膜后加入pmTOR、LC3Ⅱ、Beclin-1一抗和β-actin內(nèi)參（稀釋度均為1∶1 000），4℃搖床孵育過夜。次日洗膜后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋度均為1∶5 000），室溫孵育1 h，洗膜后于暗室內(nèi)加入顯影劑并曝光掃描。采用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達(dá)水平，以LC3Ⅱ與LC3Ⅰ條帶灰度值的比值反映LC3Ⅱ的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光染色檢測結(jié)果 與Sham組比較，CLP組海馬組織Iba-1、Iba-1/CD86和Iba-1/CD206陽性細(xì)胞數(shù)量增加（均P＜0.05）。與CLP組比較，CLP+Ra組海馬組織Iba-1/CD86陽性細(xì)胞數(shù)量減少，Iba-1/CD206陽性細(xì)胞數(shù)量增加（均P＜0.05），見圖1、表1。

Fig.1 Double immunostaining of Iba-1/CD86 and Iba-1/CD206 of microglia from hippocampus in three groups(×100)圖1 3組海馬組織小膠質(zhì)細(xì)胞Iba-1/CD86與Iba-1/CD206免疫熒光雙染色結(jié)果（×100）

2.2 海馬組織炎癥因子檢測結(jié)果與Sham組比較，CLP組海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β水平均升高（均P＜0.05）；與CLP組比較，CLP+Ra組TNF-α和IL-1β水平減低，IL-10和TGF-β水平升高（均P＜0.05），見表2。

Tab.1 Comparison of Iba-1/CD86 and Iba-1/CD206 labeled microglia from hippocampus between three groups表1 3組海馬組織Iba-1/CD86和Iba-1/CD206標(biāo)記陽性小膠質(zhì)細(xì)胞計數(shù)比較 （n=6，個/視野，±s）

Tab.1 Comparison of Iba-1/CD86 and Iba-1/CD206 labeled microglia from hippocampus between three groups表1 3組海馬組織Iba-1/CD86和Iba-1/CD206標(biāo)記陽性小膠質(zhì)細(xì)胞計數(shù)比較 （n=6，個/視野，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與CLP組比較，P＜0.05

組別Sham組CLP組CLP+Ra組F Iba-1/CD86雙染Iba-1+14.5±3.8 82.5±9.4a 73.5±3.6a 212.992＊＊Iba-1+/CD86+10.8±3.2 72.7±7.3a 36.8±3.7ab 227.692＊＊Iba-1/CD206雙染Iba-1+15.7±2.2 81.5±7.9a 77.5±9.0a 166.955＊＊Iba-1+/CD206+5.2±1.2 9.8±1.5a 33.0±4.9ab 143.180＊＊

Tab.2 Comparison of TNF-α,IL-1β,IL-10 and TGF-β levels in hippocampus between three groups表2 3組小鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β水平的比較 （n=6，ng/g，±s）

Tab.2 Comparison of TNF-α,IL-1β,IL-10 and TGF-β levels in hippocampus between three groups表2 3組小鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β水平的比較 （n=6，ng/g，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與CLP組比較，P＜0.05

組別Sham組CLP組CLP+Ra組F TNF-α 83.8±10.2 311.5±39.5a 173.3±22.8ab 108.487＊＊IL-1β 32.3±2.4 72.6±4.2a 52.2±6.1ab 121.454＊＊IL-10 48.5±7.5 86.7±11.8a 147.2±17.2ab 90.280＊＊TGF-β 26.2±5.0 49.0±7.1a 76.3±11.9ab 51.986＊＊

2.3 Western blot檢測結(jié)果 與Sham組比較，CLP組海馬組織p-mTOR上調(diào)，LC3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)下調(diào)（均P＜0.05）。與CLP組比較，CLP+Ra組海馬組織p-mTOR下調(diào)，LC3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)上調(diào)（均P＜0.05），見圖2、表3。

3 討論

3.1 膿毒癥導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化 CLP法是誘發(fā)膿毒癥動物模型的金標(biāo)準(zhǔn)和經(jīng)典方法，穿孔處擠出的糞便可引起腹腔感染，被結(jié)扎盲腸缺血壞死可釋放炎癥因子，引起全身炎癥反應(yīng)［9］。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥腦病小鼠海馬組織可發(fā)生小膠質(zhì)細(xì)胞活化，Iba-1為其標(biāo)志物［12］，分泌TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子［5］。本研究參照課題組前期研究成果制備小鼠CLP模型［10］，與Sham組比較，CLP組Iba-1陽性細(xì)胞數(shù)量增加，TNF-α和IL-1β水平升高，提示模型制備成功。

Fig.2 The expressions of p-mTOR，LC3Ⅱ and Beclin-1 detected by Western blot assay in three groups圖2 Western blot法檢測3組p-mTOR、LC3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)情況

Tab.3 Comparison of expressions of p-mTOR,LC3Ⅱand Beclin-1 between three groups表3 3組小鼠海馬組織p-mTOR，LC3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)的比較 （n=6，±s）

Tab.3 Comparison of expressions of p-mTOR,LC3Ⅱand Beclin-1 between three groups表3 3組小鼠海馬組織p-mTOR，LC3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)的比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與CLP組比較，P＜0.05

組別Sham組CLP組CLP+Ra組F LC3Ⅱ/LC3Ⅰ0.34±0.04 0.21±0.03a 0.66±0.06ab 169.801＊＊Beclin-1 0.45±0.06 0.30±0.04a 0.86±0.07ab 141.637＊＊p-mTOR 0.46±0.21 1.11±0.10a 0.41±0.06ab 49.633＊＊

3.2 小膠質(zhì)細(xì)胞表型與自噬標(biāo)志物的選擇 小膠質(zhì)細(xì)胞約占膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的10%，屬單核巨噬細(xì)胞系，與外周單核細(xì)胞功能類似，是常駐中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的免疫細(xì)胞，通過持續(xù)性監(jiān)測危險信號來參與正常腦實質(zhì)的免疫監(jiān)控［13］。一般情況下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)；而在病理狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生活化，并通過釋放一系列細(xì)胞因子，參與神經(jīng)炎癥的發(fā)病機(jī)制［14］。神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可以分為M1和M2兩種表型。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞占活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的絕大多數(shù)，CD86為其標(biāo)志物，產(chǎn)生TNF-α、IL-1β、IL-6等致炎因子，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生的主要來源；M2型小膠質(zhì)細(xì)胞以CD206為其標(biāo)志物，分泌IL-10和TGF-β等抗炎因子，抑制炎癥反應(yīng)并發(fā)揮組織修復(fù)作用［6-7］。自噬在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和應(yīng)對細(xì)胞內(nèi)外應(yīng)激等方面發(fā)揮重要作用。Beclin-1是哺乳動物中具有自噬調(diào)節(jié)作用的基因，是重要的自噬起始因子。LC3靶向定位于自噬體膜，參與自噬的形成，當(dāng)自噬發(fā)生時，LC3Ⅰ經(jīng)泛素樣加工修飾與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成LC3Ⅱ，LC3Ⅱ蛋白結(jié)合并始終位于自噬小體膜上，是自噬小體的標(biāo)志分子［15］。mTOR在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長代謝方面發(fā)揮重要作用，也是自噬水平的重要調(diào)節(jié)者［16］。故筆者選擇mTOR、LC3Ⅱ和Beclin-1作為研究觀察蛋白。

3.3 mTOR-自噬通路調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞表型 本研究結(jié)果顯示，與Sham組相比，CLP組術(shù)后24 h小鼠海馬切片Iba-1/CD86和Iba-1/CD206陽性細(xì)胞數(shù)量增加，Iba-1/CD86陽性細(xì)胞數(shù)量大于Iba-1/CD206陽性細(xì)胞數(shù)量，TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β水平提高，p-mTOR水平上調(diào)，LC3Ⅱ和Beclin-1水平下調(diào)，提示膿毒癥小鼠海馬組織mTOR通路激活，自噬水平受到抑制，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞以M1表型為主，分泌促炎因子占優(yōu)勢，加重炎癥反應(yīng)。此前已有研究證實，中樞損傷后發(fā)生小膠質(zhì)細(xì)胞活化，以M1表型占主導(dǎo)，提示活化的小膠質(zhì)細(xì)胞是膿毒癥中樞炎性反應(yīng)的重要參與者［12］。相比于CLP組，CLP+Ra組Iba-1/CD86陽性細(xì)胞數(shù)量減少、Iba-1/CD206陽性細(xì)胞數(shù)量增加，海馬組織TNF-α和IL-1β水平下降，IL-10和TGF-β水平提高，p-mTOR水平下調(diào)，LC3Ⅱ和Beclin-1水平上調(diào)，提示Ra通過抑制mTOR通路，激活自噬，小膠質(zhì)細(xì)胞M1表型減少，M2型增加，減少促炎因子分泌，增加抗炎因子分泌，抑制炎癥反應(yīng)。結(jié)果提示提高海馬自噬活性有利于減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，與文獻(xiàn)［17］抑制自噬惡化中樞炎癥反應(yīng)的結(jié)果一致。

綜上所述，抑制mTOR通路，激活自噬，可調(diào)節(jié)膿毒癥小鼠海馬組織小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，發(fā)揮抗炎作用。mTOR-自噬通路有望作為減輕膿毒癥腦病的治療靶點進(jìn)行深入研究。