特發(fā)性膜性腎病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中GRα和GRβ的表達(dá)與臨床緩解的相關(guān)性①

孫艷玲 謝 華 林洪麗 劉 穎 張圣坤

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,大連116011)

特發(fā)性膜性腎病(Idiopathic membranous nephropathy，IMN)是成人原發(fā)性腎病綜合征的主要病理類型，國外研究報(bào)道IMN的患病率占成人INS的25%～40%[1]，而我國IMN的患病率以每年1.3%的速度升高并已達(dá)24.9%[2]。隨著血清PLA2R等特異性抗體的發(fā)現(xiàn)，IMN的發(fā)病機(jī)制有了新的進(jìn)展，但目前仍建議激素聯(lián)合免疫抑制劑進(jìn)行治療[3]。糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)是通過結(jié)合其特異受體糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor，GR)而發(fā)揮作用的，其中GRα和GRβ是影響其生物學(xué)效應(yīng)的主要亞型，GRα由于其主導(dǎo)作用一直被認(rèn)為是GC發(fā)揮作用的核心，但隨后的研究發(fā)現(xiàn)GRβ對(duì)GRα的潛在拮抗作用可能在激素抵抗眾多因素中占有主要地位，GRβ的高表達(dá)狀態(tài)可能與激素抵抗的發(fā)生過程有直接關(guān)系[4]。外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononclear cell，PBMC)中表達(dá)豐富的GR，本文通過檢測(cè)IMN患者發(fā)病和緩解時(shí)PBMC中GRα與GRβ的表達(dá)，分析其與IMN疾病活動(dòng)的相關(guān)性，探尋能反映IMN激素治療的生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇2013年10月至2015年3月于大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科經(jīng)腎活檢確診為IMN的患者26例。所有入組患者均簽署知情同意書，并經(jīng)過大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(注冊(cè)號(hào)：ChiCTR-RCH-13003503)。入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡：18～70歲；②血清白蛋白≤30 g/L，24小時(shí)尿蛋白定量≥3 500 mg；③eGFR>60 ml/(min·1.73 m2)；④首次發(fā)病的IMN未應(yīng)用激素或免疫抑制劑；⑤高血壓能夠有效控制≤130/80 mmHg或無高血壓；⑥服用ARB或ACEI藥物8周以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：①各類繼發(fā)性膜性腎病，如過敏性紫癜性腎炎、糖尿病腎病、肝炎病毒相關(guān)性腎炎、狼瘡性腎炎以及腫瘤相關(guān)性腎病等；②合并中重度高血壓、心臟病、腦血管疾病、肝臟疾病、糖尿病、惡性腫瘤等其他疾病。

入組患者的治療方案：①激素序貫治療：年齡<60歲，予甲基強(qiáng)的松龍500 mg/d連續(xù)靜脈輸液3 d，續(xù)接強(qiáng)的松40 mg/d口服8周；年齡≥60歲，予甲基強(qiáng)的松龍250 mg/d連續(xù)靜脈輸液3 d，續(xù)接強(qiáng)的松30 mg/d 口服8周；此后以每半月減量2.5 mg至20 mg/d，維持8周。如達(dá)到完全緩解，繼續(xù)按照規(guī)律減量至5 mg/d后維持8周停藥；如未達(dá)到完全緩解，則20 mg/d維持12周，再按規(guī)律減量至10 mg/d。②聯(lián)合免疫抑制劑應(yīng)用：在規(guī)律足量糖皮質(zhì)激素治療8周后，聯(lián)合應(yīng)用他克莫司，以0.05 mg/(kg·d)為起始量，監(jiān)測(cè)血藥濃度維持在4～7 ng/ml。

療效判定及隨訪：治療后尿蛋白定量≤300 mg/24 h，血清白蛋白≥35 g/L，血清肌酐正常為完全緩解(CR)；治療后尿蛋白定量下降>50%，或尿蛋白定量降至3 500 mg/24 h，血清白蛋白≥35 g/L，血清肌酐正常為部分緩解(PR)，總緩解(TR)= CR+PR；所有患者每月隨訪1次，到達(dá)CR的患者3個(gè)月隨訪1次。記錄患者隨訪過程中的24 h尿蛋白定量、血清白蛋白(ALB)、血脂、血清肌酐和血壓。

健康對(duì)照組：選擇來大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一院進(jìn)行健康體檢，經(jīng)詢問病史、體格檢查、影像學(xué)及化驗(yàn)等檢查確認(rèn)為健康，年齡、性別與腎病綜合征組匹配的志愿者10例作為對(duì)照。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集、外周血單個(gè)核細(xì)胞(PMBC)的分離及總RNA提取 健康志愿者于入選后抽取空腹靜脈血12 ml,置于EDTA抗凝；腎病綜合征患者分別留取入組患者基線(激素治療前)、聯(lián)合應(yīng)用免疫抑制劑前(規(guī)律糖皮質(zhì)激素治療8周)、達(dá)到完全緩解或部分緩解時(shí)1周內(nèi)的各抽取清晨空腹靜脈血12 ml，置于EDTA抗凝。密度離心法用人淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離PBMC，Trizol法提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，紫外分光光度法測(cè)定RNA濃度和純度。

1.2.2RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 按SYBR?PrimeSc-riptTMMaster Mix ( Perfect Real Time )RT-PCR 試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系組成：5×PrimeScript RTMaster Mix (2 μl)+ Total RNA(2 μl)+ RNase Free dH2O(6 μl),PCR儀運(yùn)行程序37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 保存。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 在primer bank中分別查得GRα、GRβ和GAPDH(內(nèi)參)引物序列，并通過NCBI的Primer BLAST功能對(duì)引物進(jìn)行驗(yàn)證，由大連TaKaRa公司合成。GRα引物：上游5′-CTATGCATGAAGTGGTTGAAAA-3′，下游5′-TTTCAGCTAACAT-CTCGGG-3′；GRβ引物：上游5′-GAAGGAAACTCCAG-CCAGAA-3′，下游5′-CCACATAACATTTTCATG-CATAGA-3′；GAPDH引物：上游5′-AGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′，下游5′-TCCACCACCCTGTTGC-TGTA-3′。PCR 反應(yīng)按SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR 試劑盒說明書進(jìn)行，采用熒光定量擴(kuò)增儀LightCycler 使用方法進(jìn)行操作，PCR 反應(yīng)體系組成：2×SYBR?Premix Ex TaqTM(10 μl)+10 μmol/L PCR Forward Primer(0.8 μl)+10 μmol/L PCR Reverse Primer(0.8 μl)+Rox Refernce Dye(50×)(0.4 μl)+cDNA溶液(2 μl)+dH2O(6 μl)Q-PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 循環(huán)。GRα和GRβ mRNA表達(dá)水平以GAPDH作為內(nèi)參，以目的基因/GAPDH的比率作為其mRNA的表達(dá)量，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果應(yīng)用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。

1.2.4Western blot分析 將收集的PBMC中加入冰冷蛋白裂解液200 μl，冰浴30 min，以1 200 r/min，4℃離心10 min。吸取上清，考馬斯亮藍(lán)G250檢測(cè)試劑盒法測(cè)定蛋白濃度。50 μg蛋白樣品上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，3%BSA室溫封閉1.5 h，加一抗4℃振蕩過夜(稀釋GRα及GRβ兩種一抗終濃度為1∶500，GAPDH一抗稀釋的終濃度為1∶2 000)，次日TBST洗膜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(終濃度為1∶2 000)，室溫孵育1.5 h，TBST洗膜，用含有辣根過氧化物酶底物的化學(xué)發(fā)光液顯色并掃描結(jié)果，通過UVP凝膠圖像處理系統(tǒng)Labworks4.6軟件掃描膠片，并分析目的條帶的灰度值進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1IMN患者基線資料及隨訪資料 26例IMN患者男女比例為3∶1，進(jìn)行12個(gè)月的隨訪，其中達(dá)到CR 9例，PR 6例，NR 11例，臨床緩解率為53.8%，隨訪過程中尿蛋白定量及血白蛋白的變化情況：根據(jù)t檢驗(yàn)計(jì)算，基線時(shí)24 h尿蛋白定量為(8 409.56±2 810.01)mg，血清白蛋白為(23.49±4.50)g/L；激素治療8周時(shí)24 h尿蛋白定量為(4 855.91±1 894.00)mg，血清白蛋白為(27.85±3.88)g/L；總緩解時(shí)24 h尿蛋白定量為(871.76±1 044.03)mg，血清白蛋白為(39.83±6.83)g/L。

2.2qRT-PCR檢測(cè)GRα和GRβ mRNA表達(dá)變化 以GAPDH為參照，與Control組相比，IMN組PBMC中GRα的表達(dá)降低(P<0.05)，而GRβ的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，如圖1所示。IMN組患者PBMC中GRα/GRβ較Control組明顯降低(P<0.05)。

激素治療8周的IMN患者GRα相對(duì)含量較基線時(shí)無明顯變化(P=0.916)，緩解時(shí)GRα相對(duì)含量較基線時(shí)有所增加(P<0.05)；激素治療8周的IMN患者GRβ相對(duì)含量較基線時(shí)有所增加(P<0.05)，緩解時(shí)GRβ相對(duì)含量較基線時(shí)無明顯變化(P=0.172)，如圖2所示。

2.3Western blot檢測(cè)GRα和GRβ蛋白的表達(dá) 以GAPDH為參照，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組樣本的表達(dá)差異，與Control組相比，IMN組GRα的表達(dá)無變化(P>0.05)，而GRβ表達(dá)明顯增高(P<0.05)，如圖3所示。

與基線組相比，激素治療8周時(shí) GRα的表達(dá)無明顯變化(P=0.685)，緩解時(shí)GRα的表達(dá)變化不明顯(P=0.674)，緩解時(shí)GRα較激素治療8周時(shí)無明顯變化(P=0.419)；與基線組相比，激素治療8周時(shí)GRβ的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，緩解時(shí)GRβ的表達(dá)不明顯(P=0.179)，緩解時(shí)GRβ較激素治療8周時(shí)明顯下降(P<0.05)，如圖4所示。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)IMN組與Control組GRα和GRβ mRNA的表達(dá)Fig.1 qRT-PCR method detected expressions of GRα and GRβ mRNA of IMN patients and controls

圖2 qRT-PCR 檢測(cè)IMN患者GRα和GRβ基因的表達(dá)Fig.2 qRT-PCR method detected expressions of GRα and GRβ gene of IMN patientsNote: GC.Glucocorticoid，baseline；GC 8 weeks.Glucocorticoid treatment 8 weeks；TR(Total remission)=CR(Complete remission)+PR(Partial remission).

圖3 Western blot檢測(cè)GRα和GRβ蛋白的表達(dá)Fig.3 Western blot method detected expressions of GRɑ and GRβ protein of IMN patients and controls

圖4 Western blot檢測(cè)IMN患者GRα和GRβ蛋白的表達(dá)結(jié)果Fig.4 Western blot method detected expressions of GRα and GRβ protein of IMN patientsNote: GC.Glucocorticoid，baseline；GC 8 weeks.Glucocorticoid treatment 8 weeks；TR(Total remission)=CR(Complete remission)+PR(Partial remission).

表1 IMN患者臨床及病理指標(biāo)與臨床緩解的COX回歸分析

Tab.1 COX regression analysis between clinical indexes，pathological indexes and clinical remission of IMN patients

Influence factorP for TrendGender0.444Age0.907Course of disease0.285Blood pressure0.43224 h urine protein0.404Serum albumin0.436Serum creatinine0.458Cholesterol0.373Triglyceride0.456Fibrinogen0.504Baseline of GRα mRNA0.022Baseline of GRβ mRNA0.915Baseline of GRα/β mRNA0.016Baseline of GRα0.516Baseline of GRβ0.623Baseline of GRα/β0.298

2.4COX回歸分析 生存分析結(jié)果顯示，年齡、病程、血壓、24 h尿蛋白定量、Alb、Scr、CH、TG、Fib、與臨床緩解無明顯相關(guān)性(P>0.05)。而基線時(shí)GRα基因表達(dá)P<0.05、基線時(shí)GRα/β基因表達(dá)P<0.05，提示其與臨床緩解相關(guān)如表1所示。

3 討論

IMN患者很大程度上對(duì)激素存在抵抗，為改善激素抵抗患者的臨床效果及其預(yù)后，近年來關(guān)于IMN患者激素抵抗[5]的機(jī)制，始終是學(xué)者們研究的熱點(diǎn)問題。糖皮質(zhì)激素首先需與GR結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用。有研究顯示，GRα和GRP具有協(xié)同作用，GRα與GRP比例失衡可能會(huì)導(dǎo)致激素反應(yīng)性改變[6]。GRα能夠結(jié)合糖皮質(zhì)激素發(fā)揮生理學(xué)、藥理學(xué)的作用，而GRβ可以抑制GRα的作用，從而阻止GRα發(fā)揮作用，兩者之間的比例也會(huì)影響糖皮質(zhì)激素的作用[6]。

在所有被檢測(cè)的組織與細(xì)胞中，GRα蛋白幾乎均有表達(dá)[7]，是介導(dǎo)GC發(fā)揮抗炎作用、引起免疫抑制反應(yīng)的主要功能性受體，GC的療效與GRα的數(shù)量、GC與GR的親和力密切相關(guān)[8]。GRβ主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，多種細(xì)胞和組織中可以檢測(cè)到GRβ的表達(dá)，GRβ含有獨(dú)特的C端氨基酸序列，該序列使其無法結(jié)合GC配體，因此阻斷其直接激活基因的表達(dá)[4]。GRβ能夠降低GRα介導(dǎo)GC的生物學(xué)效應(yīng)，首次提出了GRβ是一種內(nèi)源性GC效應(yīng)拮抗因子[9,10]。有學(xué)者檢測(cè)不同GC反應(yīng)患者的PBMC細(xì)胞漿和細(xì)胞核中GR的表達(dá)水平，因此我們推斷激素抵抗的患者PBMC內(nèi)可能存在GRα核轉(zhuǎn)位過程中的障礙，致使核內(nèi)GRα水平無明顯增高，GC也就無從發(fā)揮其相應(yīng)的作用，從而產(chǎn)生激素抵抗。針對(duì)IMN患者激素抵抗的分子機(jī)制目前仍然處于探索與假設(shè)的階段，其發(fā)病機(jī)制值得我們深入探討與研究。本次研究主要以基因及分子的表達(dá)水平為切入點(diǎn)來探討GRα及GRβ表達(dá)的變化與激素抵抗的相關(guān)性。

本次實(shí)驗(yàn)分別從基因和蛋白水平對(duì)GRα與GRβ兩種主要亞型在PBMC內(nèi)的表達(dá)差異進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)IMN組患者及Control組均有GRα mRNA和GRβ mRNA的表達(dá)，并且以GRα mRNA為主，其中IMN組的GRβ mRNA的表達(dá)與Control組相比明顯增高，GRα mRNA的表達(dá)與Control組相比明顯減低。比較GRα mRNA與GRβ mRNA的比值，可見IMN組GRα mRNA/GRβ mRNA較Control組降低，而GRβ mRNA/GRα mRNA增加，這進(jìn)一步提示，GRβ mRNA表達(dá)的增高及GRβ mRNA/GRα mRNA的增高可能影響激素抵抗的形成過程。Western blot結(jié)果提示：IMN組患者PBMC內(nèi)GRα蛋白的水平與Control組比較未見明顯改變，而GRβ蛋白的水平明顯增高，同樣支持GRβ的高表達(dá)可能為激素抵抗的因素之一。

COX回歸分析結(jié)果顯示，基線時(shí)α基因表達(dá)P=0.022<0.05；基線時(shí)β基因表達(dá)P=0.915；基線時(shí)α/β基因表達(dá)P=0.016<0.05，提示基線時(shí)基因α與α/β與臨床緩解呈相關(guān)性。本研究提示，無論IMN組患者GRβ的表達(dá)水平還是GRβ mRNA/GRα mRNA表達(dá)的比值，均高于Control組，因此提示GRβ的過表達(dá)可以導(dǎo)致IMN患者激素敏感性的下降，導(dǎo)致激素抵抗。這一結(jié)果提示阻斷GRβ mRNA的表達(dá)，可能成為治療IMN一種理想的免疫干預(yù)手段。因此，我們可以通過增強(qiáng)GRα與GC的親和力、降低GRβ受體的數(shù)量、提高GRα/GRβ等方式來減少患者的激素抵抗，提高臨床治療效果。