紅景天苷調(diào)節(jié)Nrf2/ROS通路增強U-251MG的放射敏感性①

張?zhí)N蘊 周 憲 吳永忠

(重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，重慶400030)

星形膠質(zhì)瘤是原發(fā)性腦瘤中發(fā)病率最高的一類腫瘤[1]。手術(shù)是治療腦瘤的首選方法，顯微神經(jīng)外科手術(shù)在保護正常神經(jīng)組織的情況下，能盡量切除腫瘤組織[2]。由于手術(shù)往往無法徹底切除發(fā)生侵襲的腫瘤細胞，患者術(shù)后需進行放療，但是許多腫瘤具有放療對抗性，使放療效果不佳[3,4]。盡管臨床治療采取多種方式，但惡性膠質(zhì)瘤仍容易復(fù)發(fā)。據(jù)統(tǒng)計惡性膠質(zhì)瘤確診后，通常術(shù)后存活期為12～15個月，5年存活率不足5%[5]。世衛(wèi)組織統(tǒng)計，惡性膠質(zhì)瘤是引起34歲以下腫瘤患者死亡的第二大原因[6]。中藥聯(lián)合放療有增加腫瘤放射敏感性和減輕毒副反應(yīng)的作用，在臨床上應(yīng)用較廣。紅景天是廣泛生長于亞洲和歐洲高寒地帶的珍貴藥材，被稱為高原人參。紅景天苷(Salidroside，SD)是從紅景天中提取出的主要活性成分[7]。研究顯示，紅景天苷具有廣泛的藥理活性，如增強免疫力、抗氧化和提高人體機能等[8,9]。研究顯示紅景天苷有治療抑郁、保護神經(jīng)和潛在治療癌癥的作用[10,11]。隨著技術(shù)和治療策略的進步，膠質(zhì)瘤的治療和預(yù)后取得一定進展，但5年存活率仍然很低。因此研究膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展機理和開發(fā)新的治療策略十分重要。本文研究紅景天苷對人星形膠質(zhì)瘤U-251MG放射敏感性的影響及潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 紅景天苷購自北京索萊寶科技有限公司；U-251MG細胞株購自中國科學(xué)院細胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；CCK8試劑盒購自默沙克生物；總SOD檢測試劑盒、Gpx檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；ROS檢測試劑盒購自上海翊圣生物公司；Bcl-2(ab32124)、BAX(ab32530)、Nrf2(ab71890)、HO-1(ab68477)、NQO-1(ab34173)、Ki67(ab833)、PCNA(ab15497)、β-Actin(ab8227)抗體購自Abcam公司；山羊抗兔二抗購自艾美捷科技公司。

1.2方法

1.2.1細胞的培養(yǎng)及分組 U-251MG細胞接種于90%DMEM+10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將人星形膠質(zhì)瘤細胞U-251MG隨機分成4組：對照組、紅景天苷單獨處理組(SD)、放療組和放射+SD組。SD組和放射+SD組細胞貼壁后，換含50 nmol/L紅景天苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)；放療組和放射+SD組細胞用6 MV X射線醫(yī)用直線加速器照射，劑量率為2 Gy/min，射野大小為10 cm×10 cm，給予劑量為10 Gy。在放療結(jié)束后48 h，收集細胞進行實驗分析。

1.2.2CCK8檢測 向96孔板中加100 μl細胞懸液，將細胞在正常條件下預(yù)培養(yǎng)。待細胞貼壁后，SD組和放射+SD組細胞用含50 nmol/L紅景天苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)，對照組和放療組使用正常的培養(yǎng)基培養(yǎng)，放療組和更換培養(yǎng)基后的放射+SD組細胞使用射線處理。處理后各組細胞正常培養(yǎng)24、48、72、96 h，每孔加10 μl CCK8溶液，混勻后，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，酶標儀測定450 nm處吸光值。

1.2.3流式細胞術(shù) 紅景天苷和放射處理后各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰酶將細胞消化成單個懸浮細胞，4℃離心機中1 000 r/min離心5 min，收集細胞，棄上清，預(yù)冷的PBS洗2次。細胞用100 μl結(jié)合緩沖液，加Annexin-V-FITC，混勻后避光冰上靜置15 min。轉(zhuǎn)移至流式檢測管，加PBS，上機前2 min加PI，迅速檢測。

1.2.4氧化應(yīng)激指標的檢測 收集細胞，用預(yù)冷的PBS洗2次后重懸，超聲破碎，離心取上清作為待檢測樣品。按照相關(guān)試劑盒說明書，檢測氧化應(yīng)激指標。

1.2.5蛋白質(zhì)印跡 收集細胞，加含苯甲基磺酰氟的細胞裂解液，冰上裂解30 min。4℃離心機中12 000 r/min 離心，上清為總蛋白。BCA法檢測上清中總蛋白含量，加5×蛋白上樣緩沖液，混勻后，沸水浴10 min，15 000 r/min離心10 min；等量蛋白樣品用12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液中，室溫下封閉1 h；轉(zhuǎn)移膜至一抗液，4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次10 min；轉(zhuǎn)移至二抗液，室溫下孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min；加顯影液，顯影及拍照。

1.2.6裸鼠分組及處理 裸鼠經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后，立體定向儀固定頭部。切開頭部皮膚后，用電鉆于冠狀縫與矢狀縫交點后鉆1 mm3小孔。取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化成單個細胞懸液，用不含血清的培養(yǎng)基洗2次。每只注射100 μl，接種5×105個細胞。接種1周后，將20只雄性裸鼠隨機分成4組：對照組、紅景天苷單獨處理組(SD)、放療組和放射+SD組，每組5只。SD組和放射+SD組大鼠腹腔注射紅景天苷50 nmol/kg，隔天1次。放療組和放射+SD組裸鼠用6 MV X射線照射，劑量率為2 Gy/min，距離100 cm、厚3 mm的鉛板遮住裸鼠其他部位，給予劑量為10 Gy，放射+SD組放療在細胞腹腔給藥后1 d進行，1周1次，共治療4周。

1.2.7免疫組化 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉裸鼠，剪開胸腔暴露心臟，注射器經(jīng)左心室進主動脈，剪開右心耳，生理藥水清洗，直到肝組織變白，加4%多聚甲醛灌注30 min，共300 ml。取腫瘤組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，切片厚度為5 μm。取石蠟切片，60℃烘片30 min，脫蠟至水，PBS洗3次。加入檸檬酸鹽緩沖液，微波爐中處理10 min，自然冷卻，PBS清洗3次，加3%過氧化氫，室溫孵育10 min，5%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min，加一抗，4℃過夜，PBS沖洗3次；加工作液，37℃溫育15 min，PBS沖洗3次，顯色劑顯色，自來水充分沖洗，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計軟件SPSS18.0分析實驗數(shù)據(jù)；兩組間比較采用t檢驗；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1紅景天苷增強放療對U-251MG細胞增殖的抑制作用 CCK8實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，SD組和放療組U-251MG細胞增殖能力明顯下降(圖1，P<0.05)；放射+SD組與SD組、放射組相比，細胞增殖倍數(shù)明顯降低。結(jié)果表明，紅景天苷和放療單獨使用時，均能抑制U-251MG細胞增殖，紅景天苷促進放療對U-251MG細胞增殖的抑制作用。

2.2紅景天苷增強放療對U-251MG細胞凋亡的促進作用 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，SD組和放療組Q2區(qū)細胞數(shù)目明顯增加，細胞凋亡比率顯著增加(圖2，P<0.05)，提示紅景天苷和放療單獨使用具有促進U-251MG細胞凋亡的作用。放射+SD組與SD組、放療組相比，細胞凋亡比率顯著增加(圖2，P<0.05)。實驗結(jié)果表明，紅景天苷增強放療誘導(dǎo)的U-251MG細胞凋亡。

2.3紅景天苷增強放療對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 與對照組比，SD組和放療組細胞中Bax的表達顯著上調(diào)，Bcl-2的表達顯著下調(diào)(圖3，P<0.05)。與SD組和放療組相比，放射+SD組細胞中Bax的表達顯著上調(diào)，Bcl-2的表達顯著下調(diào)(圖3，P<0.05)。實驗結(jié)果表明，紅景天苷增強放療提升U-251MG細胞中Bax/Bcl-2比率的作用。

2.4紅景天苷增強放療對U-251MG氧化應(yīng)激反應(yīng)的誘導(dǎo)作用 與對照組相比，SD組和放療組細胞中ROS和MDA的含量顯著升高，SOD和Gpx的活性顯著降低(圖4，P<0.05)，結(jié)果提示紅景天苷和放療在單獨使用時，都能誘導(dǎo)U-251MG細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。與SD組和放療組相比，放射+SD組細胞中ROS和MDA的含量顯著上升，SOD和Gpx的活性顯著降低(圖4，P<0.05)。實驗結(jié)果表明，紅景天苷促進放療誘導(dǎo)的U-251MG細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖1 CCK8檢測細胞增殖Fig.1 CCK8 to detect cell proliferation folds of each group cellsNote: Compared with the control group，**.P<0.01;compared with the SD group or the Radiation group，##.P<0.01.

圖2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡Fig.2 Flow cytometry to detect apoptosis of each group cellsNote: Compared with the control group，*.P<0.05;compared with the SD group or the Radiation group,#.P<0.05.

圖3 蛋白質(zhì)印跡檢測凋亡相關(guān)蛋白表達Fig.3 Western blot to detect expression of apoptosis related proteinsNote: Compared with the control group，*.P<0.05;compared with the SD group or the Radiation group，#.P<0.05.

圖4 氧化應(yīng)激指標的檢測Fig.4 Detection of Oxidative stress indicatorNote: Compared with the control group，*.P<0.05;compared with the SD group or the Radiation group，#.P<0.05.

2.5紅景天苷增強放療對Nrf2通路相關(guān)蛋白表達的影響 與對照組相比，SD組和放療組Nrf2的表達無明顯變化(圖5，P>0.05)；SD組HO-1的表達顯著下調(diào)(圖5，P<0.05)，NQO-1的表達沒有顯著差異(圖5，P>0.05)，放療組NQO-1的表達顯著下調(diào)(圖5，P<0.05)。放射+SD組與SD組、放療組相比，Nrf2、HO-1和NQO-1的表達均顯著下調(diào)(圖5，P<0.05)。實驗結(jié)果表明，紅景天苷增強放療對Nrf2通路相關(guān)蛋白表達的影響。

2.6紅景天增強放療對小鼠體內(nèi)U-251MG膠質(zhì)瘤生長的抑制作用 與對照組相比，SD組和放療組裸鼠體內(nèi)腫瘤重量顯著下降，腫瘤組織中Ki67和PCNA的表達顯著下調(diào)(圖6，P<0.05)。放射+SD組與SD組、放療組相比，裸鼠體內(nèi)腫瘤重量顯著降低，腫瘤組織中Ki67和PCNA的表達顯著下調(diào)；(圖6，P<0.05)。實驗結(jié)果表明，紅景天苷增強放療對小鼠體內(nèi)膠質(zhì)瘤U-251MG生長的抑制作用。

圖5 蛋白質(zhì)印跡檢測Nrf2通路相關(guān)蛋白的表達Fig.5 Western blot to detect expression of Nrf2 pathway related proteinsNote: Compared with the control group，*.P<0.05;compared with the SD group or the Radiation group,#.P<0.05.

圖6 紅景天苷對U-251MG生長的影響

Fig.6 Effect of Salidroside on growth of U-251MG

Note: A.Tumor weight was detected in Vivo;B.Expression of Ki67 was detected by immunohistochemical;C.Expression of PCNA was detected by immunohistochemical.Compared with the control group，*.P<0.05;compared with the SD group or the Radiation group，#.P<0.05.

3 討論

腫瘤放射治療是利用放射線治療腫瘤的一種局部治療方法。大約70%的癌癥患者需要接受放射治療，放射療法是治療惡性腫瘤的主要方法之一[12]。放射治療的效果取決于癌細胞的放射敏感性，增殖活躍的細胞敏感性更高[13]。正常生理條件下，增殖和凋亡共同維持機體的平衡，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，細胞凋亡受到抑制，而增殖不受限。許多研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，如Hu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能抑制乳腺癌、肝癌、胃癌和惡性膠質(zhì)瘤的細胞增殖，增殖的抑制與G1/G2期阻滯有關(guān)。本文研究結(jié)果與前人研究一致，紅景天苷單獨使用時能抑制U-251MG細胞增殖，增強放療對U-251MG增殖的抑制作用。

在腫瘤的治療中，放療通過誘導(dǎo)細胞凋亡達到治療的目的。放療細胞經(jīng)紅景天苷加藥處理后，凋亡細胞比率顯著上升。Zeng等[11]研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能誘導(dǎo)卵巢癌凋亡；Fan等[15]研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞凋亡。Western blot實驗進一步驗證紅景天苷對細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響。Bcl-2家族在凋亡的調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，其中Bax抑制凋亡，Bcl-2促進凋亡[16]。在多數(shù)腫瘤中，Bax表達下調(diào)，Bcl-2表達上調(diào)[17]。許多抗腫瘤藥物將凋亡相關(guān)蛋白作為治療癌癥的靶向蛋白[18]。本研究結(jié)果顯示，射線照射后的細胞加紅景天苷處理后，細胞中Bax/Bcl-2顯著升高，表明紅景天苷增強放療對U-251MG細胞凋亡的誘導(dǎo)作用。

細胞結(jié)構(gòu)受到損傷時，ROS的含量急劇升高，MDA是脂質(zhì)氧化損傷的重要標志[19]。Gpx內(nèi)源性抗氧化劑，催化過氧化氫分解，保護生物膜的完整性[20]。目前認為射線直接作用于有機分子產(chǎn)生自由基，引起DNA損傷和與生物大分子反應(yīng)，導(dǎo)致不可逆損傷[21]。研究結(jié)果顯示，紅景天苷在單獨使用時，能促進U-251MG細胞氧化應(yīng)激。加藥處理放射細胞后，增強放療對U-251MG氧化應(yīng)激反應(yīng)的誘導(dǎo)作用。

Nrf2通路能啟動下游多種保護性蛋白的表達，如抗氧化類、解毒酶類、分子伴侶等[22]。HO-1和NQO-1是Nrf2下游關(guān)鍵蛋白，HO-1能抗氧化、抑制細胞凋亡；NQO-1為還原型輔酶/醌氧化還原酶，催化毒性的苯醌轉(zhuǎn)化為低毒性的氫醌和羥基化合物，在機體的解毒代謝中發(fā)揮重要作用[23]。研究顯示，在U-251MG中Nrf2高表達，進而刺激下游解毒和抗氧化基因的表達，增強腫瘤的抗放射性和耐藥性[24]。本研究結(jié)果顯示，紅景天苷下調(diào)放療組U-251MG細胞中Nrf2、HO-1和NQO-1的表達，減弱U-251MG細胞的解毒和抗氧化能力。

體內(nèi)實驗中，腹腔注射紅景天苷到模型裸鼠后進行放療，腫瘤生長速度明顯放緩，且放射+SD組裸鼠腫瘤組織中Ki67和PCNA的陽性細胞明顯較少。Ki67和PCNA是腫瘤細胞增殖能力良好的指標[25]，陽性細胞減少表明增殖速度減緩。表明體內(nèi)實驗中，紅景天苷增強放療對U-251MG增殖的抑制作用。

綜上所述，本文通過體內(nèi)和體外實驗，發(fā)現(xiàn)紅景天苷可能通過調(diào)節(jié)Nrf2/ROS通路，增強放療對U-251MG增殖的抑制作用、凋亡和氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)作用。