黃芪多糖緩解急性腦缺血再灌注損傷的氧化應(yīng)激反應(yīng)和免疫功能紊亂①

何 佳 鄢 波 宋曉征 伍雪英

(三六三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，成都610041)

腦卒中是世界范圍內(nèi)常見的疾病之一，以高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率為主要特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類生命與健康，其中缺血性腦卒中占80%以上[1]。缺血性腦卒中大腦供血主動(dòng)脈發(fā)生狹窄或閉塞，導(dǎo)致腦組織急劇缺氧，引起局部組織缺血性壞死[2]。缺血后血流的再灌注可以挽救瀕臨梗死的神經(jīng)細(xì)胞，但一些患者缺血再灌注會(huì)加重神經(jīng)細(xì)胞的損傷[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注引起的損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，氧化應(yīng)激反應(yīng)和免疫功能紊亂是導(dǎo)致腦缺血性損傷的重要因素[4,5]。目前雖然對(duì)腦缺血的病理生理機(jī)制的研究已經(jīng)取得重大進(jìn)展，但治療的方法和手段仍然有限。黃芪為豆科植物屬蒙古黃芪、膜莢黃芪的干燥根，是歷史悠久、應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥[6]。黃芪的主要成分有黃芪多糖、黃芪皂苷、氨基酸等。黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，AP)是黃芪的主要活性成分，具有廣泛的藥理活性。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可以參與免疫調(diào)節(jié)，作為敏化劑參與2型糖尿病的治療，具有抗病毒、抗衰老、抗腫瘤的作用[7-10]。黃芪多糖在急性腦缺血再灌注損傷中的相關(guān)研究很少出現(xiàn)。本研究利用大腦中動(dòng)脈線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，探究黃芪多糖對(duì)急性腦缺血再灌注大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)和免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 清潔級(jí)SD大鼠50只，雄性，體重250～300 g，由凱學(xué)生物科技(上海)有限公司提供。黃芪多糖(純度>97%，CAS：89250-26-0)購自百靈威科技有限公司；HE染色試劑、Tunel染色試劑均購自碧云天；兔抗大鼠Bcl-2、BAX、GAPDH、NLRP3、ASC一抗購自Thermo Fisher Scientific；cleaved-caspase-1(p20)一抗和山羊抗兔二抗及顯影液購自Abacam公司；ELISA檢測(cè)試劑盒購自ED公司；谷胱甘肽(Glutathione，GSH)超 氧 化 物 歧 化 酶(Superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1大鼠分組及急性腦缺血再灌注模型的構(gòu)建 大鼠隨機(jī)分成5組，健康大鼠對(duì)照組(Ctrl)；模型組(I/R model);加藥組按黃芪多糖的濃度分成3組，10 mg/kg組、20 mg/kg組、50 mg/kg組。模型組和加藥組在實(shí)驗(yàn)前需要建立急性腦缺血再灌注大鼠模型。黃芪多糖采用腹腔注射給藥，每天1次，連續(xù)6周。

大鼠建模前24 h禁食，不限制水?dāng)z入。用10%的水合氯酸腹腔注射對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，大鼠采取仰臥位于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上固定。分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈；用動(dòng)脈夾對(duì)頸外動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎，在頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處剪小口，將線栓經(jīng)切口處插入大腦中動(dòng)脈始端。栓塞大腦中動(dòng)脈，栓塞6 min后，緩慢拔出線栓，恢復(fù)血流灌注?？p合切口，對(duì)傷口進(jìn)行消毒處理，涂抹抗生素預(yù)防感染。

1.2.2HE染色 斷頭處死大鼠，取腦，選取大鼠缺血局部區(qū)域的大腦皮層，用預(yù)冷的PBS清洗3次，清除雜質(zhì)。用4%的多聚甲醛在4℃環(huán)境下固定2 h。預(yù)冷的PBS清洗3次，再用30%、50%、70%的酒精依次脫水處理。脫水后，進(jìn)行石蠟包埋。切片后按照HE染色液說明書進(jìn)行染色，于光鏡下觀察并拍照。

1.2.3Tunel染色 石蠟切片于二甲苯中脫蠟10 min,換新鮮的二甲苯，再脫蠟10 min。依次用無水乙醇、90%乙醇、70%乙醇、蒸餾水處理2 min。加蛋白酶K于室溫下處理20 min，PBS洗3次，清除蛋白酶K。生物素標(biāo)記后，樣品的DAB顯色。隨機(jī)選取5個(gè)視野，在光鏡下觀察并拍照。使用軟件Image J分析陽性細(xì)胞比率。

1.2.4免疫印跡法 用預(yù)冷的PBS將待檢測(cè)的組織細(xì)胞清洗3次，分離細(xì)胞后，加入裂解液在冰上裂解30 min。于4℃冷凍離心機(jī)中15 000 r/min離心10 min，上清中即為總蛋白。BSA法測(cè)定蛋白濃度，制備蛋白樣品，95℃金屬浴10 min，15 000 r/min離心10 min。用12%的SDS-PAGE分離蛋白樣品，將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%的脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入一抗4℃ 孵育過夜，TBST洗膜3次，加二抗在室溫下孵育1 h?；瘜W(xué)熒光試劑顯影，使用Bio-Rad成像系統(tǒng)分析。

1.2.5氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 取大鼠腦組織，冰上勻漿，4℃冷凍離心機(jī)中14 000 r/min離心30 min，取上清。按照試劑說明書，檢測(cè)組織中GSH、MDA的含量和SOD的活力。

1.2.6ELISA檢測(cè)炎癥因子水平 斷頭取血，收集血液樣品，2 500 r/min離心5 min，移液槍轉(zhuǎn)移血清至新收集管。按照實(shí)際說明書進(jìn)行操作，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-18的含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)。P<0.01認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1黃芪多糖緩解腦缺血再灌注對(duì)大鼠腦組織的損傷 通過HE染色觀察不同濃度黃芪多糖對(duì)急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織病變的影響。對(duì)照組組織切片中，細(xì)胞邊界清晰，胞漿豐富，折光性強(qiáng)。與對(duì)照組相比較，I/R模型組大鼠腦組織出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞排列紊亂，折光度差，出現(xiàn)大量空泡(圖1)；與I/R模型組相比較，加藥各組大鼠腦組織病變出現(xiàn)緩解，且黃芪多糖濃度為50 mg/kg時(shí)，黃芪多糖對(duì)腦組織病變的緩解作用最明顯(圖1)。結(jié)果顯示，黃芪多糖能夠有效緩解急性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的腦組織損傷。

2.2黃芪多糖抑制腦缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬 光學(xué)顯微鏡下觀察健康組大鼠腦組織切片，未見Tunel染色陽性顆粒；I/R模型組與健康組相比較，核膜結(jié)構(gòu)不明顯、核固縮、有空泡，出現(xiàn)大量Tunel染色陽性顆粒，表明大鼠模型構(gòu)建成功(圖2，P<0.01)；與模型組相比較，隨著AP劑量由10、20、50 mg/kg 增加，各組Tunel染色陽性顆粒隨AP濃度增加而減少(圖2，P<0.01)。表明黃芪多糖能抑制急性腦缺血再灌注損傷對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。

2.3黃芪多糖抑制腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 Western blot結(jié)果顯示，模型組與對(duì)照組相比較，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯下降，BAX蛋白表達(dá)顯著上升(圖3，P<0.01)；與模型組相比較，加藥組Bcl-2的表達(dá)顯著上調(diào)，BAX的表達(dá)顯著下調(diào)，且隨著黃芪多糖濃度的增加，變化越明顯(圖3，P<0.01)。結(jié)果提示黃芪多糖通過調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的腦組織細(xì)胞凋亡。

圖1 HE染色檢測(cè)腦組織病變(HE，×400)Fig.1 Brain tissue lesion was detected by HE staining(HE，×400)

2.4黃芪多糖抑制腦缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng) 模型組與對(duì)照組相比較，組織中GSH、SOD的含量明顯下降，MDA的含量明顯上升，表明缺血再灌注后大鼠腦組織脂質(zhì)氧化反應(yīng)強(qiáng)烈，伴隨有腦組織自由基的聚集和抗氧化酶活性下降(圖4，P<0.01)；加藥組與模型組相比較，隨著AP濃度的增加，GSH和SOD的濃度逐漸上升，而MDA的濃度逐漸下降(圖4，P<0.01)。以上結(jié)果表明，黃芪多糖能抑制腦缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

2.5黃芪多糖減弱腦缺血再灌注誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng) 通過ELISA檢測(cè)大鼠血液中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-18的含量，分析黃芪多糖對(duì)急性腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組與對(duì)照組相比較，大鼠血液中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-18的含量顯著上升(圖5，P<0.01)；

圖2 Tunel檢測(cè)黃芪多糖對(duì)缺血再灌注大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響(×400)Fig.2 Effect of astragalus polysaccharide on apoptosis of brain tissue cells in rats with ischemia reperfusion were detected by Tunel(×400)Note:*.P<0.01 compared with control group；#.P<0.01 compared with model group.

圖3 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression level of apoptosis related protein was detected by Western blotNote:*.P<0.01 compared with control group；#.P<0.01 compared with model group.

加藥組與模型組相比較，發(fā)現(xiàn)大鼠血液中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-18的濃度隨著AP濃度的增加而降低(圖5，P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪多糖減弱急性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

2.6黃芪多糖對(duì)炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 蛋白印跡檢測(cè)炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，模型組NLRP3、ASC、cl-caspase-1的蛋白表達(dá)水平明顯上升(圖6，P<0.01)；加藥組與模型組相比較， NLRP3、ASC、 cl-caspase-1的蛋白表達(dá)水平隨著黃芪多糖濃度的增加而逐漸降低，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的關(guān)系(圖6，P<0.01)。結(jié)果表明，黃芪多糖下調(diào)NLRP3、ASC和cl-caspase-1的表達(dá)，抑制炎癥小體的形成。

圖4 試劑盒檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)Fig.4 Oxidative stress indicator was detected by KitNote:*.P<0.01 compared with control group；#.P<0.01 compared with model group.

圖5 ELISA檢測(cè)大鼠血清中炎癥因子水平Fig.5 Level of inflammatory factor were detected by ELISANote:*.P<0.05 compared with control group；#.P<0.05 compared with model group.

圖6 蛋白印跡檢測(cè)炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.6 Expression level of inflammation related proteins were detected by Western blotNote:*.P<0.01 compared with control group；#.P<0.01 compared with model group.

3 討論

缺血再灌注損傷是器官移植、心胸外科、血管外科和普通外科手術(shù)的主要挑戰(zhàn)。缺血性器官內(nèi)代謝供應(yīng)和需求的不平衡導(dǎo)致了嚴(yán)重的組織缺氧和微血管功能障礙。急性腦缺血再灌注損傷的病理和生理機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜。之前的研究發(fā)現(xiàn)，急性腦缺血再灌注會(huì)刺激局部腦組織釋放出大量的氧自由基，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的發(fā)生從而加重對(duì)神經(jīng)的損傷[11]。除了造成神經(jīng)損傷外，氧自由基還會(huì)影響血管內(nèi)皮延伸和神經(jīng)組織的修復(fù)。與前人研究一致，本文在構(gòu)建大鼠模型后，HE染色檢測(cè)大鼠急性腦缺血再灌注損傷區(qū)域，發(fā)現(xiàn)腦組織出現(xiàn)嚴(yán)重的病變。研究表明黃芪多糖能緩解急性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠腦組織病變。

氧化應(yīng)激為機(jī)體內(nèi)氧化系統(tǒng)失衡，造成體內(nèi)生物大分子損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡指生理?xiàng)l件下機(jī)體受刺激后，在一系列基因的參與下，細(xì)胞自主有序的程序性死亡[12]。許多研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，如Zhang等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖通過積累Nrf1抑制人心肌細(xì)胞的凋亡；Yin等[14]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖通過調(diào)控mTOR信號(hào)通路抑制細(xì)胞自噬，通過調(diào)控caspase-3依賴的信號(hào)通路抑制自噬。與上述研究一致，本文研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能有效抑制大鼠急性腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

腦缺血再灌注引起B(yǎng)cl-2、caspase、Bax、P53等高度保守基因的激活、表達(dá)及調(diào)控是細(xì)胞凋亡啟動(dòng)的關(guān)鍵[15]。其中Bcl-2和Bax通過形成同源或異源二聚體發(fā)揮作用[16,17]。本文研究結(jié)果顯示，模型組大鼠組織中Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)，Bax表達(dá)顯著上調(diào)。觀察給藥組可以發(fā)現(xiàn)，隨著黃芪多糖給藥濃度的增加，Bcl-2表達(dá)逐漸升高，而Bax的表達(dá)逐漸降低。Xie等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖通過下調(diào)Bax蛋白水平、上調(diào)Bcl-2蛋白，保護(hù)人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞免受缺氧/再氧化損傷。Bcl-2能有效降低線粒體外膜的通透性，抑制細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而抑制凋亡的發(fā)生[19]。而Bax通過抑制Bcl-2的活性，促進(jìn)凋亡的發(fā)生。在細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中，Bcl-2表達(dá)下調(diào)、Bax表達(dá)上調(diào)，綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃芪多糖抑制急性腦缺血再灌注大鼠腦組織細(xì)胞凋亡。SOD活性和GSH、MDA的含量是反映機(jī)體氧化水平的可靠指標(biāo)，能間接反映缺血再灌注大鼠腦組織的損傷程度[20,21]。大量的研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可以影響SOD的活性和GSH、MDA的含量。如Zhong等[22]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖通過減少血管活性物質(zhì)的產(chǎn)生，減少氧化應(yīng)激損傷，增加SOD的含量，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生，改善血流性能和微循環(huán)灌注，從而減輕嚴(yán)重燙傷兔心肌的損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪多糖作用于模型鼠后，缺血區(qū)域組織中SOD、GSH的含量明顯上升，MDA的含量明顯降低。SOD催化體內(nèi)超氧自由基的歧化反應(yīng)，而GSH是重要的抗氧化劑和氧自由基清除劑。表明黃芪多糖增強(qiáng)模型鼠清除氧自由基的能力和抗氧化能力，降低氧自由基對(duì)DNA和細(xì)胞的損傷。

當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)病變時(shí),常常伴隨著炎癥反應(yīng)。很多研究表明，黃芪多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用。如Zhou等[23]發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可以抑制肺癌細(xì)胞，降低模型小鼠血液中IL-6、TNF-α的含量。如Xie等[24]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖通過NF-κB細(xì)胞信號(hào)通路，使細(xì)胞免受鎘誘導(dǎo)的毒性傷害，文中指出黃芪多糖能降低IL-6、TNF-α、IL-1β等炎性因子的含量。Lv等[25]發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖通過下調(diào)PKC-α-ERK1/2-NF-κB信號(hào)通路降低IL-6、TNF-α的含量。與前人研究一致，本文研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能緩解腦缺血再灌注誘導(dǎo)的免疫紊亂。

炎性體是由多種蛋白組成的復(fù)合體，具有調(diào)節(jié)炎性因子分泌和釋放的作用[26]。NLRP3炎性體由NLRP3、ASC和cl-caspase-1組成。當(dāng)NLRP3高表達(dá)或被激活時(shí)，加工剪切炎性因子前體，形成成熟的炎性因子，進(jìn)而產(chǎn)生一系列的反應(yīng)[27]。Tian等[28]發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能下調(diào)NLRP3的表達(dá)，減少炎癥體的形成，進(jìn)而減弱小鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能抑制NLRP3炎性小體的活化。NLRP3炎癥小體活化后，成熟的cl-caspase-1降解IL-1β和IL-18前體，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)活性氧的產(chǎn)生能激活NLRP3炎性小體。黃芪多糖抑制模型鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，可能與NLRP3炎性小體的激活相關(guān)，但具體的作用機(jī)制需要深入研究。

在急性腦缺血再灌注損傷大鼠中，黃芪多糖可以改善腦組織病變；上調(diào)Bcl-2蛋白，下調(diào)BAX蛋白，抑制細(xì)胞自噬；提高SOD的活性，增加GSH的含量，降低MDA的含量；降低血液IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-18的含量；下調(diào)NLRP3、ASC、cl-caspase-1蛋白表達(dá)。綜上所述，黃芪多糖能緩解大鼠急性腦缺血再灌注損傷引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)和免疫功能紊亂。下一步計(jì)劃研究黃芪多糖對(duì)急性腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生緩解作用的相關(guān)分子機(jī)制。