臍帶間充質干細胞體外調節(jié)CD34+CD126-細胞向巨核系誘導的研究①

徐志國 陳義柱 施旭斌 汪 峰 楊旭巍 鈕移坤 任振輝 王擁軍 劉 超 孫 泉

(浙江省臍帶血造血干細胞庫，協(xié)和華東干細胞基因工程有限公司，湖州313001)

目前臨床上嚴重血小板減少患者主要的治療手段為輸注捐獻血小板，但血小板保存期短、貯存條件苛刻且輸注存在血液傳播疾病風險等缺陷，制約了血小板的臨床應用[1-3]。臍帶血作為除骨髓及外周血外，造血干細胞的又一豐富來源，擁有易于采集、免疫原性低且擴增效率高等優(yōu)勢[4-7]。體外誘導臍帶血造血干細胞向巨核細胞分化為拓寬血小板來源開辟了新的研究思路。間充質干細胞作為基質細胞是造血微環(huán)境中重要的組成部分，具有支持造血與調控造血功能的重要作用。大量文獻表明，間充質干細胞通過旁分泌作用向造血微環(huán)境釋放刺激巨核細胞分化的TPO、IL-6等細胞因子。但也有研究者提出，間充質干細胞具有維持造血干細胞“干性”的功能，能阻礙其分化成熟[8]?；诖?，本研究選擇巨核細胞祖細胞CD34+CD126-細胞作為分化起始細胞，以臍血單個核細胞為對照，在細胞因子誘導向巨核細胞分化的基礎上，設置間充質干細胞直接接觸與非直接接觸兩種實驗條件，檢測誘導后細胞增殖、特異性標志物表達及巨核細胞集落生成等結果，揭示CD34+CD126-細胞向巨核細胞誘導分化及間充質干細胞對誘導過程的調節(jié)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 淋巴細胞分離液 LymphoprepTM、細胞緩沖液EasySepTMBuffer、人造血祖細胞預富集混合物RosetteSepTMHuman Hematopoietic Progenitor Cell Enrichment Cocktail、人CD34陽性細胞分選試劑盒EasySepTMHuman CD34 Positive Selection Kit、人PE陽性細胞分選試劑盒EasySepTMHuman PE Positive Selection Kit、無血清擴增培養(yǎng)基StemSpanTMSerum-Free Expansion MediumⅡ、巨核細胞誘導擴增補充物StemSpanTMMegakaryocyte Expansion Suppl-ement、巨核細胞集落染色試劑盒The MegaCultTM-C Complete Kit with Cytokines(美國Stem Cell公司)；PE-CD34、FITC-CD73、PE-CD90、PE-CD105、PE-CD44、PE-CD29、FITC-CD45、PE-CD31、PE-HLA-DR(美國BD公司)；FITC-CD41(美國Novus公司)；PE-CD126(美國R&D Systems公司)；IMDM培養(yǎng)基，絲裂霉素C Mitomycin C(美國Sigma公司)。

1.1.2實驗樣本 健康、足月剖宮產(chǎn)新生兒的臍帶與臍帶血取自于湖州婦保院健康產(chǎn)婦(乙肝、丙肝、HIV及梅毒等血清學反應顯示為陰性)，并經(jīng)產(chǎn)婦授權同意。入選實驗樣本標準：臍帶血體積160 ml以上，白細胞數(shù)(WBC)含量10×109L-1以上，采集到實驗開始時間間隔12 h以內，無凝血；臍帶除結扎兩頭外中間段長度不小于10 cm；采集到實驗開始時間間隔24 h以內。

1.2方法

1.2.1分離臍帶血單個核細胞(Cord blood mon-onuclear cells，CBMCs) 用10 ml的EasySepTMBuffer稀釋10 ml臍血樣品；在SepMateTM-50管中加入15 ml LymphoprepTM，吸取稀釋的樣品加入此SepMateTM-50管中；室溫1 200 g離心10 min，倒出上清至新的標準管；加滿EasySepTMBuffer洗滌富集細胞，室溫300 g離心10 min，棄上清，重復此步操作一次；用培養(yǎng)液懸浮細胞，待用。分離前后血球計數(shù)儀再次計數(shù)白細胞數(shù)，流式細胞儀測定CD34+細胞百分率。

1.2.2臍帶血造血祖細胞預富集 在分離CBMCs操作的基礎上，在樣品中加入500 μl RosetteSepTMCocktail，室溫孵育10 min(標準50 ml離心管中加入10 ml臍血樣品操作后)。預富集前后血球計數(shù)儀計數(shù)白細胞數(shù)，流式細胞儀測定CD34+細胞百分率。

1.2.3CD34+CD126-細胞磁珠分選 分選過程分兩步進行：①CD34+細胞分選 2×108cells/ml細胞濃度起懸CBHPC并添加至5 ml流式管；添加分選試劑(100 μl/ml樣本量)至樣品，混勻并室溫孵育15 min；添加磁珠(50 μl/ml樣本量)至樣品，混勻并室溫孵育10 min；添加EasySepTMBuffer加滿至2.5 ml 并混勻，流式管放入磁極室溫孵育5 min；磁極連流式管倒置2～3 s，倒掉上清，移除管子，內含分選的細胞；重復洗脫4次；用緩沖溶液管壁收集細胞，流式檢測CD34陽性表達率。②CD34+CD126-細胞分選 重懸上述CD34陽性分選細胞，濃度調整為1×108cells/ml，添加樣品至5 ml流式管；添加FCR阻滯劑(100 μl/ml樣本量)至樣品并混勻；將PE-CD126(0.3～3.0 μg/ml樣品)加入樣品中，混勻并室溫孵育15 min；添加分選試劑(100 μl/ml樣本量)至樣品，混勻并孵育15 min；添加磁珠(50 μl/ml樣本量)至樣品，混勻并孵育10 min；添加緩沖溶液至2.5 ml并混勻；流式管放入磁極，室溫孵育5 min；磁極連流式管倒置并收集上清。重復洗脫6次，收集洗脫液。合并多次洗脫液并離心，用緩沖溶液起懸細胞，流式檢測CD126陽性表達率。

1.2.4臍帶間充質干細胞(Umbilical mesenchymal stem cells，UCMSCs)的分離培養(yǎng) 將臍帶消毒后剪成1～2 mm3左右組織塊，均勻平鋪于T75細胞培養(yǎng)瓶底部，加入15 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，5%CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)基每3天換液一次，待細胞融合率達到細胞培養(yǎng)瓶底部面積的80%～90%時行胰酶消化，傳代培養(yǎng)。流式檢測P2代UCMSCs的CD73、CD90、CD105、CD44、CD29、CD45、CD31、CD34、HLA-DR陽性表達率。

1.2.5CD34+CD126-細胞向巨核細胞誘導及間充質干細胞對誘導過程的調節(jié) 設置3個實驗組：無間充質組(No MSC)、MSC接觸共培養(yǎng)組(MSC contact coculture)、MSC非接觸共培養(yǎng)組(MSC non-contact coculture)。以臍帶血單個核細胞(CBMCs)作為對照組。3個實驗組均使用StemSpan?SFEMII培養(yǎng)基及細胞因子StemSpan?CC220(SCF、IL-6、 IL-9 與TPO細胞因子組合)，稀釋CD34+CD126-細胞至2×104cells/ml；在24孔細胞培養(yǎng)板中以1 ml/孔接種細胞懸液，在37℃與5% CO2條件下培養(yǎng)7 d；收獲細胞，用IMDM洗滌離心細胞1次，然后用含有StemSpan?CC220的SFEMII培養(yǎng)液重懸細胞至1×105cells/ml；在24孔細胞培養(yǎng)板中以1 ml/孔接種細胞懸液，在37℃與5% CO2條件下再次培養(yǎng)7 d。MSC共培養(yǎng)組(接觸或非接觸)中MSC誘導前貼壁于24孔板底部，20 μg/ml的MMC去增殖處理3 h。MSC接觸共培養(yǎng)組將CD34+CD126-細胞懸液接種于MSC上即可，MSC非接觸共培養(yǎng)組則將CD34+CD126-細胞接種于Transwell小室。誘導擴增前流式細胞儀測定誘導細胞CD34與CD41表型。在誘導培養(yǎng)的7 d和14 d末評價細胞，包括：計數(shù)懸浮細胞數(shù)，流式細胞儀測定懸浮細胞CD34與CD41表型。

1.2.6細胞表面標志檢測 收集待細胞制成單細胞懸液，細胞密度調整為106個/ml，熒光標記目標單抗，流式細胞儀檢測細胞免疫表型，小鼠IgG作同型對照。數(shù)據(jù)結果用CellQuest軟件進行分析。

1.2.7巨核祖細胞分析檢測 檢測采用StemCell公司的MegaCultTM-C人巨核細胞祖細胞檢測試劑盒。①CFU-MK培養(yǎng)：離心管中加入2.55 ml MegaCultTM-C培養(yǎng)基、0.45 ml含因子IMDM，0.15 ml CD34+CD126-細胞懸液(濃度為1.1×106cells/ml)，1.8 ml冷的膠原蛋白溶液，共4.95 ml最終體積。分配0.75 ml 最終混合物至雙腔室玻片的每個腔。以CBMCs為對照。雙腔室玻片置于無菌培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2、≥95%濕度環(huán)境下孵育培養(yǎng)12 d。②脫水與固定：孵箱中取出腔室玻片，白色吸水卡覆蓋凝膠吸水后放入1∶3 甲醇：丙酮溶液，室溫(15～25℃)下固定20 min。③染色：用0.5 ml含5%人血清Tris/NaCl緩沖液水化玻片上培養(yǎng)物，孵育20 min。加入0.5 ml的一抗(抗CD41的抗體)或對照抗體，孵育30 min，緩沖液沖洗3次(3 min/次)。加入0.5 ml的生物素標記的羊抗小鼠IgG，孵育30 min，緩沖液沖洗3次(3 min/次)。加入0.5 ml的堿性磷酸酶結合抗生物素蛋白的并孵育30 min，緩沖液沖洗3次(3 min/次)。加入0.5 ml堿性磷酸酶底物溶液，處理15 min，緩沖液沖洗3次(3 min/次)。涂0.5 ml伊萬斯藍染色 5 min，洗掉過多的染色液，晾干玻片。④CFU-Mk集落計數(shù)與鏡下形態(tài)：用低倍物鏡掃描整個玻片，計數(shù)玻片上的不同大小的CFU-Mk集落分布：小(每集落 3～20 個細胞)、中(每集落21～49個細胞)，大(每集落≥50個細胞)以及非Mk集落(每集落≥20個細胞，常為粒細胞/單核細胞譜系)和混合Mk集落(非Mk細胞與巨核細胞共同存在)。高倍物鏡詳細觀察CFU-Mk集落。

2 結果

2.1臍帶血CD34+CD126-細胞與CBMCs的分離 實驗選用臍帶血體積為176 ml，臍帶血白細胞數(shù)(WBC)含量為12.1×109L-1；從臍帶血采集到實驗開始時間間隔為344 min，無凝血，流式細胞儀測得CD34陽性細胞率為0.33%(圖1A)。80 ml臍帶血進行造血祖細胞預富集獲得HPCs細胞數(shù)為5.76×106，CD34陽性細胞率為35.99%(圖1B)。對HPCs先進行CD34陽性磁珠分選獲得細胞數(shù)為1.72×106，隨后進行CD126陽性分選去除，最終獲得CD34+CD126-細胞數(shù)為1.43×106，其CD34陽性細胞率為87.28%(圖1C)，CD126陽性率為0.26%(圖1D)。使用淋巴細胞分離液與離心管從臍帶血中分離得到臍帶血單個核細胞(CBMCs)，80 ml臍帶血獲到CBMCs 細胞數(shù)為2.24×108，CD34陽性細胞率為1.66%，見圖1。

2.2臍帶間充質干細胞(UCMSCs)的分離 實驗選用臍帶長度為18 cm，采集到實驗開始時間間隔為446 min。擴增培養(yǎng)至P2代用于實驗，流式細胞儀測得該P2代MSC的CD73陽性細胞率為95.36%，CD90陽性細胞率為99.72%，CD105陽性細胞率為98.00%，CD44陽性細胞率為98.55%，CD29陽性細胞率為99.94%，CD45陽性細胞率為1.81%，CD31陽性細胞率為0.83%，CD34陽性細胞率為0.08%，HLA-DR陽性細胞率為0.05%，見圖2。

圖1 臍帶血CD34+CD126-細胞與CBMCs分離前后表面標志物的表達Fig.1 Expression of surface markers of umbilical cord blood CD34+CD126- cells and CBMCs before and after isolationNote: CD34 positive cells of umbilical cord blood samples(A),CD34 positive cells of HPCs(B),CD34 positive cells of CD34+CD126- cells(C),CD126 positive cells of CD34+CD126- cells(D),CD34 positive cells of CBMCs(E).

2.3誘導培養(yǎng)后細胞增殖情況 CD34+CD126-細胞組誘導7 d或是14 d后，在不同實驗組中獲得懸浮細胞數(shù)均顯著大于對照組CBMCs(均為P<0.001)；且MSC組(CD34+CD126-細胞與MSC接觸或非接觸共培養(yǎng)組)獲得懸浮細胞數(shù)都顯著高于無MSC組(均為P<0.001)；對照組CBMCs亦是同樣結果(P7 d<0.05，P14 d<0.001)，可見臍帶間充質干細胞分泌的細胞因子對于巨核細胞分化過程中細胞增殖具有促進作用。而這種促進作用無關于誘導細胞是否與間充質干細胞接觸，誘導7 d或是14 d后，CD34+CD126-細胞與MSC接觸共培養(yǎng)組和非接觸共培養(yǎng)組之間獲得懸浮細胞數(shù)均無顯著性差異(均為P>0.05)，對照組CBMCs亦然(均為P>0.05)(圖3A、B)。誘導14 d后顯微鏡下觀察懸浮細胞狀態(tài)，可見兩種細胞生長狀態(tài)良好，懸浮細胞貼著貼壁的間充質細胞周圍生長(圖3C～F)。

圖2 臍帶間充質干細胞的表面標志物表達Fig.2 Expression of surface markers of umbilical cord mesenchymal stem cellsNote: Cell were labeled with antibodies against human antigens CD73，CD90，CD105，CD44，CD29，CD45，CD31，CD34，HLA-DR，as analyzed by FACS.

2.4誘導前后細胞表面標志物變化

2.4.1CD34表達變化 誘導前CD34+CD126-細胞組CD34陽性細胞數(shù)為(1.64±0.09)×104，CBMCs細胞組CD34陽性細胞數(shù)為(3.51±0.43)×102。誘導7 d，CD34+CD126-細胞各組CD34陽性細胞數(shù)均有顯著增加(均為P<0.001)，表明培養(yǎng)基中細胞因子組合能促進CD34+細胞擴增。其中MSC組(CD34+CD126-細胞與MSC接觸或非接觸共培養(yǎng)組)CD34陽性細胞數(shù)均顯著大于No MSC組(均為P<0.001)，提示MSC分泌的細胞因子有助于加速CD34+細胞擴增。接觸組CD34細胞數(shù)顯著小于非接觸組(P<0.05)，我們推測MSC微環(huán)境對造血干細胞具有“干性維持”的作用，能夠減緩CD34+細胞的分化與增殖速率(圖4A)。誘導14 d后CD34+CD126-細胞組(No MSC)CD34陽性細胞率降低至1.60%±0.70%，CBMCs組(No MSC)為1.50%±0.38%，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；

圖3 CD34+CD126-細胞與CBMCs各組誘導后懸浮細胞增殖情況Fig.3 Proliferation of suspension cells after induction of CD34+CD126- cells and CBMCs groupsNote: Number of suspension cells after 7 days of induction of CD34+CD126- cells and CBMCs groups(A);number of suspension cells after 14 days of induction of CD34+CD126- cells and CBMCs groups(B);cell morphology under microscope after 14 days of induction of CD34+CD126- cells(no MSC group)(C),CD34+CD126- cells(MSC contact coculture group)(D),CBMCs(no MSC group)(E),CBMCs(MSC contact coculture group)(F);***.P<0.001,scale bar=300 μm.

CD34+CD126-細胞與MSC接觸共培養(yǎng)組為1.92±0.60%，CBMCs與MSC接觸共培養(yǎng)組1.81±0.54%，兩者比較亦差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；CD34+CD126-細胞與MSC非接觸共培養(yǎng)組為2.21±0.38%，CBMCs與MSC非接觸共培養(yǎng)組為1.77±0.54%，兩者比較同樣差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明誘導14 d后，CD34+CD126-細胞組與CBMCs組中CD34+細胞分化充分(圖4B)。

2.4.2CD41表達變化 CD41作為巨核細胞的特異性分化抗原，誘導前CD34+CD126-細胞組和CBMCs細胞組的CD41陽性細胞數(shù)分別為(3.59±0.57)×102、(5.49±0.84)×102。誘導7 d后，CD34+CD126-細胞各組CD41陽性細胞數(shù)均有顯著增加(均為P<0.001)，其中MSC組(CD34+CD126-細胞與MSC接觸或非接觸共培養(yǎng)組)CD41陽性細胞數(shù)顯著大于No MSC組(均為P<0.001)，表明MSC分泌的細胞因子具有促進CD34+CD126-細胞向巨核細胞分化的功能。而CD34+CD126-細胞與MSC共培養(yǎng)是否接觸對于CD41陽性細胞數(shù)而言無顯著性差異(P>0.05)， 我們推測MSC微環(huán)境作用并不影響CD34+CD126-細胞向巨核細胞分化。CBMCs組亦得到上述結論，但CD34+CD126-細胞各組誘導7天CD41陽性細胞率上升值均顯著大于CBMCs的對應各組(均為P<0.001)，這表明誘導前篩選巨核細胞祖細胞作為起始細胞對于巨核細胞誘導效率的提升具有顯著作用(圖4C)。誘導14 d后，隨著巨核細胞不斷成熟，兩組細胞(CD34+CD126-細胞組和CBMCs細胞組)獲得的CD41陽性細胞數(shù)均有顯著上升，各組間CD41陽性細胞數(shù)比較后所得結論與上述誘導7 d的結論保持一致(圖4D)。

圖4 CD34+CD126-細胞與CBMCs各組誘導后細胞表面標志物變化Fig.4 Changes of cell surface markers after induction of CD34+CD126- cells and CBMCs groupsNote: Changes in the number of CD34 positive cells after 7 days of induction of CD34+CD126- cells and CBMCs groups(A);changes in the percentage of CD34 positive cells after 14 days of induction of CD34+CD126- cells and CBMCs groups(B);changes in the number of CD41 positive cells after 7 days of induction of CD34+CD126- cells and CBMCs groups(C);changes in the number of CD41 positive cells after 14 days of induction of CD34+CD126- cells and CBMCs groups(D),*.P<0.05,***.P<0.001.

2.5巨核細胞集落計數(shù)與染色 CD34+CD126-細胞與CBMCs進行CFU-Mk誘導培養(yǎng)12 d后，顯微鏡下計數(shù)不同大小的CFU-Mk集落分布情況發(fā)現(xiàn)，CD34+CD126-細胞組誘導得到的大CFU-Mk(≥50個細胞)與中CFU-Mk(21～49個細胞)數(shù)量顯著大于CBMCs組(PCFU-Mk；≥50 cells<0.01，PCFU-Mk；21-49 cells<0.05)。而大CFU-Mk來源于較原始的Mk祖細胞，這表明CD34+CD126-細胞作為Mk祖細胞而言更為原始(圖5A)。巨核細胞和血小板均表達糖蛋白GPⅡb/Ⅲa(CD41)，固定及染色后呈現(xiàn)粉紅色；伊萬斯藍對比染色使所有細胞的細胞核呈現(xiàn)淡藍色。鏡下觀察到血小板團塊形狀不規(guī)則，粉紅色染色均勻，細胞核不可見，血小板如碎片般圍繞著CFU-Mk分布(圖5B～F)。

3 討論

體外定向誘導臍帶血造血干細胞分化并獲得成熟的產(chǎn)血小板巨核細胞應用于臨床，其關鍵之一是誘導分化的效率問題[9，10]。本實驗為提高分化效率，一方面從分化細胞本身出發(fā)，選擇具有更高巨核細胞增殖分化潛能的祖細胞；另一方面探索間充質干細胞對巨核細胞誘導過程的影響，找出進一步提高分化效率的方案。

不同來源的巨核祖細胞具有不同高低的增殖潛能[11,12]。研究者發(fā)現(xiàn)，在未分化的胎兒骨髓中，存在一種高增殖潛能巨核細胞，能形成大于300細胞(300～1 000)的巨核細胞集落，其增殖能力遠大于成人骨髓的CD34+細胞[13]。臍帶血中所含的造血干/祖細胞含量與骨髓中相似，臍帶血造血干細胞向巨核細胞分化常用經(jīng)Ficoll分離得到的單個核細胞作為研究目標，其方法雖簡便但分化及擴增效率不高[14,15]。本實驗選擇CD34+CD126-細胞為分化起始細胞，CD126為IL-6的受體(IL-6R)，根據(jù)是否表達CD126，CD34+細胞可分為兩個亞群，CD34+CD126+亞群被刺激向粒系與淋巴系細胞分化，而CD34+CD126-亞群則會向紅系與巨核系細胞分化。本實驗中，誘導CD34+CD126-細胞向巨核細胞分化，獲得大型與中型的巨核細胞集落顯著大于單個核細胞組，由此可見進行巨核祖細胞誘導前篩選對于提高巨核細胞誘導效率具有非常重要的意義。

間充質干細胞(MSC)作為造血環(huán)境中的基質細胞，對造血微環(huán)境的調控起很大的作用[16,17]。Celebi等[18]指出MSC可產(chǎn)生TPO、SCF、白介素等細胞因子，并能誘導多種細胞因子間的協(xié)同作用促進造血干/祖細胞的增殖分化，本研究中MSC不僅能促進CD34+細胞增殖分化，還促進了CD419+細胞的增殖。MSC的調節(jié)作用還表現(xiàn)在其對造血干/祖細胞的“干性維持”上。Jing等[19]發(fā)現(xiàn)，間充質干細胞分泌趨化因子SDF-1，造血干/祖細胞表面趨化因子受體CXCR4結合SDF-1，并通過整合素吸附于間充質干細胞表面，進而穿過MSC細胞間空隙遷移至MSC細胞層之下的微環(huán)境中，CD34+細胞在這種微環(huán)境中增殖分化速率顯著降低。我們推測本研究中CD34+CD126-細胞在與MSC直接接觸誘導分化中，大部分CD34+CD126-細胞接受MSC分泌細胞因子的刺激而大量增殖；小部分CD34+CD126-細胞遷移至MSC的微環(huán)境中增殖速率大大降低。

綜上所述，選擇相對原始、分化潛能高的巨核細胞祖細胞，以間接接觸的方式在誘導過程中引入間充質干細胞，有望提高最終獲得成熟巨核細胞的數(shù)量，應用于臨床緩解目前血小板供應緊張的問題。