潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜中E選擇素與P選擇素的表達及意義

李威　李震　陳君卓　趙君雅　徐杰　于鵬 官杰

【摘要】 目的：探討E選擇素、P選擇素在潰瘍性結腸炎（UC）大鼠腸黏膜中的表達水平及意義。方法：選取2018年3-6月健康的雄性（Sprague Dawkey，SD）大鼠65只，分為空白對照組（n=12）和實驗組（n=53）?？瞻讓φ战M不處理，于實驗組中隨機選取12只SD大鼠進行預實驗，篩選最合適劑量的TNBS（2，4，6-三硝基苯磺酸）造模劑構建潰瘍性結腸炎的模型。剩余大鼠進行正式造模，按不同的解剖時間將其分為A、B、C組，各12只。通過每天觀察體重及一般情況（精神狀態(tài)，糞便形狀、顏色等）的改變，依據(jù)疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分，記錄實驗大鼠狀態(tài)，初步判斷大鼠潰瘍性結腸炎的嚴重程度。分別于第3、7、14天處死大鼠，使用大體形態(tài)損傷指數(shù)（colon macroscopic damage index，CMDI）對結腸評分，判斷潰瘍程度，采用ELISA法檢測腸黏膜中E選擇素、P選擇素的含量指標，同時評估結腸病理改變，綜合得出E選擇素與P選擇素的含量與潰瘍程度的關系。結果：實驗組大鼠的DAI、CMDI評分均明顯高于空白對照組，且實驗組結腸組織的病理情況鏡下潰瘍改變顯著。空白對照組、A、B、C組間的E選擇素、P選擇素含量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。潰瘍性結腸炎由逐漸嚴重至恢復的過程中，各實驗組腸黏膜組織中的E選擇素、P選擇素水平均先逐漸升高隨后下降，但C組含量仍均明顯高于A組。結論：在潰瘍性結腸炎發(fā)展過程中，隨著結腸潰瘍程度加重，E選擇素和P選擇素水平升高。隨著結腸潰瘍程度減輕，E選擇素和P選擇素水平降低。E選擇素與P選擇素可能起到了促進UC病情發(fā)展的作用，可作為UC診斷的動態(tài)參考指標，以及為臨床研究UC發(fā)病機制提供新的方向。

【關鍵詞】 UC; SD大鼠; CMDI; DAI; P選擇素; E選擇素

【Abstract】 Objective：To investigate the expression levels and significance of E-selectin and P-selectin in intestinal mucosa of rats with ulcerative colitis（UC）.Method：A total of 65 healthy male（Sprague Dawkey，SD）rats were selected from March to June 2018，they were divided into blank control group（n=12）and experimental group（n=53）.The blank control group was not treated，12 SD rats were randomly selected from the experimental group for the pre-experiment，and the most appropriate dose of TNBS（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid）was screened to build the model of ulcerative colitis.The remaining rats were formally moulded and divided into group A，group B and group C according to different anatomical time，with 12 rats in each group.Through daily observation of body weight and changes in general conditions（mental state，shape and color of feces，etc.），according to disease activity index（DAI）score，the status of experimental rats were recorded and the severity of ulcerative colitis in rats was preliminarily determined.Rats were sacrificed on 3，7 and 14 d respectively，and colon macroscopic damage index（CMDI）was used to assess the degree of ulceration.ELISA method was used to detect the content indexes of E-selectin and P-selectin in intestinal mucosa，and meanwhile the pathological changes of Colon were evaluated.The correlation between the content of E-selectin and P-selectin and the degree of ulcer was obtained.Result：The DAI and CMDI scores of rats in the experimental group were significantly higher than those in the blank control group，and the pathological changes of colonic ulcer in the experimental group were significantly changed under the microscope.The contents of E-selectin and P-selectin in blank control group，A，B and C groups were compared，the differences were statistically significant（P<0.05）.In the course of recovery from ulcerative colitis，the levels of E-selectin and P-selectin in intestinal mucosa of experimental group increased gradually at first and then decreased，but the contents of E-selectin and P-selectin in group C were still significantly higher than those in group A.Conclusion：During the development of ulcerative colitis，the levels of E-selectin and P-selectin increased with the aggravation of the degree of colon ulcer.The levels of E selectin and P-selectin decreased with the decrease of degree of colon ulcer.E-selectin and P-selectin may play a role in promoting the development of UC，which can be used as a dynamic reference indicator for the diagnosis of UC and provide a new direction for the clinical study on the pathogenesis of UC.

【Key words】 UC; SD rats; CDMI; DAI; P-selectin; E-selectin

First-authors address：Qiqihar Medical University，Qiqihar 161000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.01.008

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種直腸和結腸慢性非特異性炎癥性疾病，該疾病可發(fā)生于任何年齡，多見于青年和中年人，男女比例相近，近年來此病的發(fā)病率呈明顯上升的趨勢[1]。臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便，患者病情經(jīng)久不愈、反復發(fā)作，常表現(xiàn)為發(fā)作期與緩解期交替出現(xiàn)。UC的發(fā)病機制尚未明確，目前認為該病與遺傳、環(huán)境和機體免疫功能紊亂等有關，在這些因素的作用下，腸道免疫系統(tǒng)功能紊亂。同時，臨床研究還表明UC患者血小板數(shù)量增多和血小板激活是兩個值得重視的表現(xiàn)。腸道免疫系統(tǒng)紊亂能募集炎癥細胞釋放炎性介質，造成組織損傷和功能障礙，其中細胞黏附分子在腸道免疫反應與炎癥進程中起到重要作用。E選擇素和P選擇素是細胞黏附分子中選擇素家族的成員，免疫學者逐漸開始關注它們在UC發(fā)生發(fā)展進程中的作用。E選擇素僅在激活的內皮細胞表達，由內皮細胞刺激產生，炎癥因子白介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、細菌脂多糖（LPS）等刺激內皮細胞后，E選擇素的表達顯著增加。E選擇素通過識別細胞特異性糖蛋白配體SleX、SleA介導細胞的早期黏附，從而介導白細胞在炎癥部位聚集，促進炎癥反應[2-3]。P選擇素與潰瘍性結腸炎關系密切[4]，P選擇素參與啟動早期炎癥反應，同時它也是血小板活化的金標準及內皮細胞活化的重要指標[5]。炎癥性腸?。↖BD）活動期存在內皮細胞損傷和血小板活化，因此人們越來越重視P選擇素在IBD病理過程中的作用[6]。在組織發(fā)生炎癥時，白細胞等炎性細胞釋放刺激因子誘導P選擇素在血小板及內皮細胞上表達，而P選擇素與PSGL-1有特殊的親和力，又介導P選擇素與中性粒細胞的黏附，促進炎癥反應發(fā)生。本研究通過TNBS構建UC模型，ELISA法檢測UC病損區(qū)E選擇素、P選擇素含量，進而探討其在潰瘍性結腸炎發(fā)病過程中的表達及意義，為指導臨床UC的診斷、治療提供新的思路?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取2018年3-6月健康的雄性SD大鼠65只，SPF級，體重180～250 g（購自齊齊哈爾醫(yī)學院實驗動物中心）飼養(yǎng)于通風、溫暖、定時光照的環(huán)境下，專用全營養(yǎng)飼料及清潔水喂養(yǎng)。動物質量合格證編號：No.43004700032111;實驗動物使用許可證號：SYXK（黑）2018-0012。

1.2 主要試劑和器材 TNBS試劑（批號SLBT1675）購于Sigma-Aldrich公司;E選擇素試劑盒、P選擇素受體試劑盒，均購于上海恒遠公司;微型臺式離心機（Thermo Electron Corporation美國）;切片機（Leica RM2255德國）;石蠟包埋機（Leica EG1150H德國）。

1.3 方法

1.3.1 造模 根據(jù)趙平等[7]方法進行造模，65只SD大鼠隨機選取12只進行預實驗，選取12只作為空白對照組，正常飼養(yǎng)，不做處理;剩余41只大鼠作為實驗組，全部進行造模，造模前禁食不禁水48 h，經(jīng)7%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔麻醉，向結腸灌注TNBS（100 mg/kg）與50%的乙醇0.25 mL組成TNBS-乙醇混合液。于灌胃器8 cm處標記刻度，由肛門輕緩插入至刻度線，勻速推藥，之后將灌胃器緩慢旋出。為防藥液外溢，采用頭低尾高體位，輕提鼠尾倒置10 min，放回籠中待自然清醒。注意保暖，密切觀察大鼠生理狀態(tài)。

1.3.2 動物分組 造模后每天記錄大鼠的活躍狀況，第3天從可作為實驗動物模型的鼠中，隨機處死5只大鼠，對其進行解剖，觀察結腸組織以確認UC大鼠模型的建立。對剩余36只大鼠從一編號到三十六，通過隨機數(shù)字表抽三十六個數(shù)，按大小排序，依次每十二個數(shù)對應的大鼠為一組，以此隨機分為A、B、C組，各12只，分別于造模后3、7、14 d處死。

1.3.3 標本制備 分別處死模型組A、B、C三組大鼠后，取肛門至盲腸末端的結腸段，清理腸系膜并吸干水分，便于肉眼觀察結腸大體形態(tài)以及病理取材。

1.4 觀察指標與判定標準 （1）疾病活動度（DAI）變化參考馮陳慧等[8]標準，進行DAI評分，DAI=（體重+大便形態(tài)+大便出血）/3，DAI分值越大，說明潰瘍性結腸炎越嚴重。（2）肉眼觀察結腸大體形態(tài)，并對結腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）進行評分，大鼠腸道無縮短，腸壁黏膜光滑，紋理清晰，腸壁厚度均勻，未見水腫、糜爛及潰瘍計0分;大鼠腸管縮短，腸壁大片充血，黏膜紋理紊亂、腫脹，腸道內有橘黃色的黏性物質附著計1分;腸管明顯縮短，腸壁大片充血，水腫，腸道表面有黑褐色膜狀物附著，易于撕脫，膜狀物質下可見糜爛的腸黏膜內為半成型稀便計2分;腸道內殘留不成形稀便，腸管縮短僵硬，腸壁淤血情況好轉，黏膜表面有顆粒感，腸道內有棕色膜狀物質附著，其下可見明顯潰瘍形成，管腔內積氣積便計3分，CMDI評分越高，說明潰瘍性結腸炎越嚴重[9]。（3）剪取病變明顯的結腸段標本用10%的福爾馬林固定;常規(guī)石蠟包埋并經(jīng)HE染色;觀察結腸組織的病理學改變[7]。（4）ELISA檢測UC大鼠腸黏膜組織中的的E選擇素、P選擇素水平。比較分析A、B、C三組大鼠CMDI、DAI評分以及UC大鼠腸黏膜組織中的E選擇素、P選擇素水平。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;多組間采用采用F檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠的DAI評分比較 對大鼠造模后狀態(tài)進行觀察，每天觀察兩次?？瞻讓φ战M大鼠活躍，反應靈敏，進食正常，毛色光滑，排便正常。造模后實驗A、B、C三組大鼠均出現(xiàn)少動，精神萎靡，進食減少，毛色不光滑，出現(xiàn)不同程度的腹瀉，對各組大鼠進行DAI評分。其中空白對照組體重未變化，糞便形態(tài)正常，隱血陰性，DAI分數(shù)為0分。實驗A組體重下降1%～5%，糞便形態(tài)松散，隱血陽性，平均DAI分數(shù)為（1.00±0.20）分。實驗B組體重下降>15%，糞便為稀便，肉眼血便，平均DAI分數(shù)為（2.60±0.30）分。實驗C組有12只大鼠，體重下降10%～15%，糞便形態(tài)松散，肉眼血便，平均DAI分數(shù)為（2.00±0.15）分。A組至B組大鼠癥狀逐漸嚴重，C組有好轉趨勢。

2.2 各組大鼠的CMDI評分比較 空白對照組大鼠腸道無縮短，腸壁黏膜光滑，紋理清晰，腸壁厚度均勻，未見水腫、糜爛及潰瘍，CMDI分數(shù)為0分。實驗A組可見大鼠腸管縮短，腸壁大片充血，黏膜紋理紊亂，腫脹，腸道內有橘黃色的黏性物質附著，腸道內殘留不成形稀便，平均CDMI評分為（1.50±0.15）分;實驗B組大鼠腸管縮短、僵硬，其腸壁內淤血情況好轉，腸黏膜表面呈現(xiàn)顆粒感，腸道內有棕色膜狀物質附著，其下可見明顯潰瘍形成，平均CDMI評分為（4.00±0.20）分。實驗C組大鼠腸管明顯縮短，腸壁大片充血，表面有黑褐色膜狀物附著，膜狀物質下可見糜爛的腸黏膜，平均CDMI評分為（3.00±0.30）分。由上述可知，CMDI評分隨造模時間的變化先升高后下降，表明A組至B組結腸損傷程度逐漸嚴重，C組損傷程度減輕。

2.3 各組大鼠的病理分析 鏡下可見空白對照組大鼠的結腸黏膜上皮完整，杯狀細胞豐富，各層結構清晰，未見水腫、糜爛及潰瘍，僅有少量淋巴細胞浸潤;實驗A組鏡下可見腸黏膜的基本結構消失，杯狀細胞減少，隱窩結構扭曲，黏膜下層見大量中性粒細胞浸潤，腸壁水腫，可見出血病灶，肌層變厚;實驗B組鏡下可見黏膜隱窩上皮變性壞死，腸黏膜糜爛，腸壁壞死深達肌層，炎性細胞浸潤腸壁全層，黏膜及腺體脫落形成大片潰瘍并覆蓋黑色壞死膜狀物質，腸壁明顯水腫;實驗C組鏡下可見黏膜下大量炎性細胞浸潤，部分潰瘍開始愈合，腺體間有纖維組織增生，表現(xiàn)為肉芽組織的生成。由此可得，實驗A、B、C組大鼠表現(xiàn)為炎癥隨時間進展由逐漸加重至后期的趨于緩解。

2.4 各組間腸黏膜E選擇素、P選擇素含量比較 空白對照組、A、B、C組間的E選擇素、P選擇素含量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。隨病情由輕到重至恢復的過程中，A、B、C組中的E、P選擇素含量均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢?？瞻讓φ战M與A、B、C組比較，A組與B、C組比較，B、C兩組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。潰瘍性結腸炎由逐漸嚴重至恢復的過程中，各實驗組腸黏膜組織中的E選擇素、P選擇素水平均先逐漸升高隨后下降，但C組含量仍明顯高于A組。見表1。

3 討論炎癥性腸病發(fā)病具有明顯的地域，歐美地區(qū)患病率最高[10]。UC的發(fā)病率為（9～12）/10萬，患病率為（205～240）/10萬[11]，自身免疫反應為該病的重要發(fā)病機制，現(xiàn)已有研究表明E選擇素和P選擇素與UC的發(fā)病關系密切。

本實驗通過疾病活動度（DAI）、結腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）進行疾病評分，綜合病理損傷程度對潰瘍程度進行分級，分為輕度、中度、重度，根據(jù)不同程度的潰瘍與E選擇素和P選擇素含量的關系得出它們的相關性。與模型組對比，造模各組大鼠出現(xiàn)不同程度的精神不佳，稀便，體重下降等癥狀，結腸病損部位出現(xiàn)不同程度的損傷;比較實驗組之間的病情變化，第3～7天逐漸加重，至第14天病情出現(xiàn)好轉。

E選擇素在血管內皮細胞上特異表達，身體處于健康狀態(tài)時，處于極低水平，當機體存在疾病時，損傷區(qū)域E選擇素含量升高，可以增加血管表面通透性，促進炎癥細胞活化，介導炎癥發(fā)生[12]，有研究表明，E選擇素在UC發(fā)病過程中水平升高，提示在UC發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用[13]。本實驗在大鼠潰瘍性結腸炎發(fā)病的不同時期，對腸黏膜組織的E選擇素水平進行測定，結果發(fā)現(xiàn)隨著實驗組大鼠潰瘍性結腸炎由輕度逐漸加重的過程中，炎癥區(qū)腸黏膜中E選擇素的含量先明顯升高，隨著E選擇素濃度降低，UC出現(xiàn)了轉歸，表明E選擇素在病損區(qū)的濃度同病情發(fā)展呈正相關性。與鄭煜凱等[14]研究成果相符，實驗證明了E選擇素在潰瘍性結腸炎的發(fā)病過程中可能起到了促進UC病情發(fā)展的作用。因此E選擇素對于臨床診斷疾病發(fā)生發(fā)展，以及臨床研究UC發(fā)病原理都有重要意義。

P選擇素是一種廣泛表達于血管內皮細胞表面的細胞黏附分子受體，研究發(fā)現(xiàn)其與炎癥和腫瘤轉移有關系密切[15]。P選擇素在機體無炎癥反應時基本不表達，當組織受損或炎癥侵襲時，白細胞等炎性介質誘導在內皮細胞和血小板表面表達P選擇素，且血小板活化可釋放多種炎性因子，參與局部炎癥反應，并導致白細胞向局部炎癥累及部位趨化聚集，呈持續(xù)惡性循環(huán)[16-18]，據(jù)研究顯示，發(fā)現(xiàn)IBD患者周圍血中血小板表達P選擇素增高，且IBD患者腸黏膜經(jīng)超聲破碎后上清液中P選擇素的含量顯著增高[19]。楊權等[20]研究表明活動期UC患者血漿P選擇素明顯高于健康人及緩解期患者，與疾病發(fā)展關系密切。本實驗結果顯示，隨著潰瘍性結腸炎逐漸加重至出現(xiàn)好轉的過程中，實驗組腸黏膜的P選擇素水平從A組至B組升高，B組至C組少量降低，表明P選擇素水平同病情表現(xiàn)呈正相關性，與楊權等[20]研究結果吻合，進一步證明了在UC發(fā)展過程中由于P選擇素的增加，促進了炎癥的發(fā)生發(fā)展過程。潰瘍性結腸炎作為一種具有癌變可能的腸道疾病，研究P選擇素在UC發(fā)生發(fā)展中的作用對臨床治療潰瘍性結腸炎以及預防結腸癌變有重要意義。

綜上所述，本實驗進一步證明了隨著潰瘍性結腸炎病情逐漸嚴重，P選擇素、E選擇素于病損區(qū)濃度升高，隨疾病轉歸，濃度隨之降低。這對判斷潰瘍性結腸炎病情嚴重程度，提供了新的參考指標，也為今后進一步探索潰瘍性結腸炎的發(fā)病機制和治療提供了新的思路。

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（收稿日期：2018-10-19） （本文編輯：李瑩瑩）