化療藥物對大鼠卵巢儲備功能的影響

梁元晶 曾婷婷 路欣

【摘要】 目的：探討化療藥物順鉑對大鼠卵巢儲備功能和抗中腎旁管激素（AMH）表達的影響。方法：清潔級成年雌性SD大鼠隨機分為對照組（生理鹽水）、順鉑低劑量組和順鉑高劑量組，分別進行藥物腹腔注射。觀察動物的一般情況，稱量動物體重，ELISA方法檢測血清中AMH水平。結(jié)果：（1）與對照組相比，順鉑低劑量和高劑量組動物的一般狀態(tài)差，體重明顯降低（P<0.001）。（2）對照組注射后體重比注射前明顯升高（P<0.001），而另外兩組注射后體重均比注射前顯著降低（P<0.05）。（3）與對照組相比，順鉑低劑量和高劑量組血清AMH水平均顯著下降（P<0.001）;而與順鉑低劑量組相比，高劑量組AMH水平進一步下降（P<0.05）。結(jié)論：化療藥物順鉑能使大鼠體重和血清AMH水平顯著降低，卵巢儲備功能下降。AMH是衡量順鉑作用后大鼠卵巢儲備功能的重要生物學(xué)指標。

【關(guān)鍵詞】 卵巢儲備; 化療; ELISA

【Abstract】 Objective：To investigate the effects of chemotherapeutic agent cisplatin on anti-Müllerian hormone（AMH）expression and ovarian reserve in rats.Method：Adult SD female rats were divided into control group（saline），cisplatin low-dose group，and cisplatin high-dose group randomly.Agents were injected by intraperitoneal injection.General condition of the animal was observed.Body weight was measured.Serum AMH level was measured by ELISA.Result：（1）Compared with control group in cisplatin low-dose and high-dose groups，the general conditions of animals became worse，and the body weight decreased significantly（P<0.001）.（2）In control group，the body weight after injection increased significantly compared with before injection（P<0.001）.While in cisplatin groups，the weight after injection decreased significantly compared with before injection（P<0.05）.（3）Serum AMH levels in cisplatin groups decreased dramatically compared with control group（P<0.001）.Moreover，AMH levels in cisplatin high-dose group was much lower than that of low-dose group（P<0.05）.Conclusion：Chemotherapeutic agent cisplatin results in the decrease of body weight and serum AMH level.The lower AMH levels indicate the diminishment of ovarian reserve after cisplatin treatment.AMH is a very good marker of ovarian reserve after cisplatin administration.

【Key words】 Ovarian reserve; Chemotherapy; ELISA

First-authors address：Capital Medical University School of Basic Medical Sciences，Beijing 100069，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.07.007

據(jù)WHO統(tǒng)計，2008年城市女性惡性腫瘤發(fā)病率為248.7/10萬，較20年前增加45.35%。放療和化療是治療惡性腫瘤的重要手段，但許多化療藥物具有卵巢毒性，可導(dǎo)致卵巢儲備功能損傷，甚至引起卵巢早衰[1-3]?！奥殉矁涔δ堋笔呛饬颗月殉补δ芎蜕芰Φ闹匾笜?，它包括卵子的質(zhì)量和數(shù)量[4]?？怪心I旁管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）又稱苗勒管抑制物，在雌性體內(nèi)主要由卵巢中的生長卵泡，即初級卵泡、竇前卵泡和小的竇狀卵泡分泌。近年來，AMH評價卵巢儲備功能的作用受到廣泛關(guān)注[5-7]。但是，在化療藥物順鉑作用后，雌性大鼠體內(nèi)AMH水平是否發(fā)生改變，這種AMH水平的變化與卵巢儲備功能之間是否存在某種聯(lián)系，目前國內(nèi)尚未見相關(guān)研究報道。本研究檢測不同劑量順鉑給藥后大鼠的一般狀態(tài)、體重和血清AMH水平，探討順鉑對卵巢儲備功能的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 本研究選用健康的清潔級成年雌性SD大鼠，65～75天，體重200～250 g，共40只。動物由Harlan（Indianapolis，IN）提供。本研究中所用試劑：順鉑購于Sigma-Aldrich公司，AMH ELISA試劑盒購于Diagnostic Systems Laboratories公司。

1.2 動物模型制備及分組 SD大鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境內(nèi)，自由飲水、采食。喂養(yǎng)中的晝夜節(jié)律為12 h光照，12 h黑暗。經(jīng)過一周的適應(yīng)期后，大鼠隨機分為3組：對照組（12只）、順鉑低劑量組（16只）和順鉑高劑量組（12只）。用生理鹽水配制終濃度為0.5 mg/mL的順鉑溶液。上述三組動物分別進行腹腔注射生理鹽水1 mL、順鉑4.5 mg/kg或順鉑6.0 mg/kg，每周注射一次，共兩周。實驗過程中，定期檢查動物的一般情況并稱量體重。

1.3 標本采集 藥物注射結(jié)束后，二氧化碳吸入法麻醉并處死動物。進行心臟采血，離心，分離血清并分裝，儲存于-80 ℃。

1.4 ELISA檢測 用AMH ELISA試劑盒檢測大鼠血清中AMH的水平，具體操作按說明書進行，簡述如下。取20 μL標準品、對照品和血清樣本，加入96孔板中，孵育、洗板。再將生物素標記的抗體加入，孵育、洗板。此后，加入HRP，孵育、洗板。最后，TMB顯色，酶標儀測450 nm和620 nm處波長。該方法的檢測敏感度為0.017 ng/mL，同一次檢測的變異系數(shù)為4.6%，不同次檢測間的變異系數(shù)為8.0%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 11.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料采用（x±s）表示，運用配對t檢驗，分析各組內(nèi)藥物注射前后體重的變化;運用單因素方差分析及Post-hoc分析，對藥物注射后各組間體重的差異和AMH的差異進行統(tǒng)計學(xué)處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物一般狀態(tài)的變化 藥物注射過程中，三組動物的一般情況發(fā)生一些變化。其中，對照組大鼠生長、進食及精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，體重有所增加。順鉑低劑量組大鼠精神稍差，不活躍，略顯消瘦。而順鉑高劑量組大鼠進食量及活動明顯減少，精神倦怠，明顯消瘦。

2.2 動物體重的變化 藥物注射2周后，順鉑使動物體重顯著下降，順鉑低劑量組動物體重與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）;順鉑高劑量組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）;順鉑高劑量組與低劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。注射后，對照組體重較注射前顯著增加（t=-7.717，P=0.000），順鉑低劑量組體重較注射前明顯下降（t=2.174，P=0.046），順鉑高劑量組體重較注射前明顯下降（t=4.156，P=0.004），見表1。

2.3 血清AMH的ELISA檢測 藥物注射后，各組大鼠血清中AMH的水平為對照組（5.30±0.51）ng/mL，順鉑低劑量組（1.78±0.17）ng/mL，順鉑高劑量組（0.52±0.10）ng/mL。注射順鉑后，大鼠血清AMH水平顯著下降，順鉑低劑量組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）;順鉑高劑量組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）;順鉑高劑量組與低劑量組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.008）。

3 討論

據(jù)WHO統(tǒng)計，2008年城市女性惡性腫瘤發(fā)病率為248.7/10萬，較20年前增加45.35%。放療和化療是治療惡性腫瘤的重要手段，但許多化療藥物具有卵巢毒性，可導(dǎo)致卵巢功能損傷，甚至引起卵巢早衰[1-3，8-9]。Oktem等[10]對26例患者的卵巢形態(tài)學(xué)和功能研究顯示：化療組卵巢中原始卵泡數(shù)目明顯低于對照組，接受烷化劑治療患者的原始卵泡數(shù)目明顯低于非烷化劑組及非化療組;化療組患者的卵巢皮質(zhì)組織塊體外產(chǎn)生的雌激素量明顯低于對照組。提示化療藥物可以破壞卵巢的正常結(jié)構(gòu)，降低卵巢儲備功能。順鉑是中心以二價鉑同兩個氯原子和兩個氨分子結(jié)合的重金屬絡(luò)合物，類似于雙功能烷化劑，屬細胞周期非特異性藥物，具有細胞毒性，可抑制癌細胞的DNA復(fù)制過程，并損傷其細胞膜上的結(jié)構(gòu)，有較強的廣譜抗癌作用。在臨床用于治療卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、惡性淋巴瘤、頭頸部鱗癌、甲狀腺癌及成骨肉瘤等多種實體腫瘤，均能顯示療效。順鉑在治療惡性腫瘤的同時，也具有毒副作用，可造成多臟器損傷，例如：腎臟毒性、神經(jīng)毒性和電解質(zhì)紊亂，少數(shù)患者還可出現(xiàn)心電圖ST-T改變，肝功能損害等[11]。順鉑對卵巢也有一定的損傷。研究顯示：順鉑腹腔注射后，小鼠卵巢中卵泡計數(shù)減少，卵泡閉鎖增加，細胞間質(zhì)增生明顯，卵巢呈現(xiàn)“纖維化”改變，進而影響到卵巢功能。

卵巢儲備功能包括卵巢內(nèi)存留的卵泡數(shù)量和卵泡質(zhì)量兩個方面，代表女性配子發(fā)生及甾體激素生成的能力，可反映女性的生育潛能[4，12-13]。目前，臨床常用克羅米芬刺激試驗、第3天FSH水平和B超下卵泡記數(shù)等指標來反映卵巢儲備功能。但是，在同一個體中，常出現(xiàn)幾種指標不一致的情況，從而不能為臨床醫(yī)療提供非?？煽康囊罁?jù)。近年來，AMH評價卵巢儲備功能的作用受到廣泛關(guān)注[5-6，7，14]。AMH又稱苗勒管抑制物，是由二硫鍵連接而成的二聚體糖蛋白，是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）超家族的一個成員。與TGF-β家族其他成員的廣泛表達不同，AMH的表達僅限于性腺。在雄性，AMH主要由睪丸支持細胞表達;在雌性體內(nèi)主要由卵巢中的生長卵泡分泌。最近的研究顯示，AMH的水平可以更加準確、早期地預(yù)測卵巢儲備功能[15-16]。然而，應(yīng)用AMH作為檢測指標，探討化療藥物順鉑作用后卵巢儲備功能的變化，這方面的研究報道在國內(nèi)很少見到。

本研究筆者首先給予實驗動物腹腔注射順鉑。因為順鉑作用于大鼠的LD50為6～12 mg/kg[17]，所以筆者分別選用了順鉑低劑量（4.5 mg/kg）和高劑量（6.0 mg/kg）兩種注射濃度，其中后者相當(dāng)于順鉑的LD50，而前者約相當(dāng)于LD50的75%。研究顯示：注射順鉑后，與對照組相比，順鉑低劑量和高劑量組動物的一般狀態(tài)差，體重明顯降低（P<0.001）。而與順鉑低劑量組相比，高劑量組動物的體重再次出現(xiàn)大幅度下降（P<0.001）。此外，若對每一組動物注射前后的體重進行比較，則可發(fā)現(xiàn)：對照組注射生理鹽水后體重比注射前明顯升高（P<0.001），提示在實驗進行中，對照組動物生命活動正常，生長發(fā)育未受影響。而另外兩組動物在注射順鉑以后體重均比注射前顯著降低（P<0.05）。上述實驗結(jié)果提示，本研究中無論高劑量或低劑量順鉑腹腔注射，藥物的毒副作用均已對大鼠身體造成不同程度的傷害，阻礙了其正常的生長發(fā)育，導(dǎo)致體重的大幅度下降。隨著劑量的增加，順鉑的損傷作用也越來越嚴重。

在此基礎(chǔ)上，筆者進一步探討了順鉑對血清AMH水平的影響。文獻報道，血清AMH水平能夠間接反映生長卵泡數(shù)量和原始卵泡庫存量的變化，可以作為檢測卵巢儲備功能的重要標志物[15]。本研究顯示：注射順鉑后，與對照組相比，順鉑低劑量和高劑量組AMH水平均有顯著下降（P<0.001）。而順鉑高劑量組與低劑量組相比，AMH水平繼續(xù)降低（P<0.05）。血清AMH的降低提示注射順鉑后大鼠卵巢儲備功能的下降。結(jié)合上述體重變化趨勢，可以發(fā)現(xiàn)，化療藥順鉑可對大鼠器官系統(tǒng)造成不同程度的傷害，包括降低卵巢儲備功能。隨著順鉑使用劑量的升高，傷害將逐漸加重，卵巢儲備功能也持續(xù)大幅度下降。

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進步和化療等治療措施的廣泛應(yīng)用，部分惡性腫瘤的預(yù)后正逐步改善，患者生存期明顯延長。生存不再是腫瘤治療的唯一目的，患者對高質(zhì)量生活的渴望正受到更多關(guān)注，而卵巢功能狀態(tài)也成為衡量女性腫瘤患者生存質(zhì)量的重要指標之一[18-20]。本實驗中，應(yīng)用化療藥物順鉑能使大鼠體重和血清AMH水平顯著降低，而AMH的降低又標志著卵巢儲備功能的下降。本研究所獲結(jié)果為化療后卵巢儲備的準確檢測提供了實驗依據(jù)，并使深入探討如何在化療的同時保護卵巢儲備功能、提高患者生存質(zhì)量成為可能。

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（收稿日期：2018-06-14） （本文編輯：周亞杰）