小檗堿對PCOS大鼠子宮內(nèi)膜PPARs的表達及內(nèi)分泌代謝的影響

尹天曉 溫菁 魏巍

【摘要】 目的：探討小檗堿對多囊卵巢綜合征大鼠子宮內(nèi)膜PPARs的表達及內(nèi)分泌代謝的影響。方法：采用Poretsky造模法，對大鼠造模。造模后將大鼠隨機分為正常對照組、模型組、羅格列酮組、小檗堿組，每組10只。采用灌胃的方法給藥，正常組及模型組給予生理鹽水，每日對大鼠行陰道涂片，瑞氏染色法觀察其動情周期，OGTT測其血糖變化，用ELISA檢測E2、FSH、LH、T、INS等指標，計算HOME-IR，取大鼠卵巢及子宮進行HE染色及免疫組化。結(jié)果：小檗堿可使子宮內(nèi)膜PPARα、γ值升高，改善PCOS大鼠糖代謝異常，降低LH、T、INS水平，改善卵巢多囊樣表現(xiàn)及子宮腺肌癥樣表現(xiàn)。結(jié)論：小檗堿對子宮內(nèi)膜PPARα、γ高表達，可恢復(fù)大鼠動情周期，改善卵巢激素變化及糖代謝和胰島素抵抗，且其療效優(yōu)于羅格列酮。

【關(guān)鍵詞】 多囊卵巢綜合征; 小檗堿; 過氧化物酶體增殖物激活受體; 代謝

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Berberine on the expression and endocrine metabolism of PPARs of endometrium in rats with polycystic ovary syndrome.Method：Poretsky modeling method was used to model rats.Rats were randomly divided into the normal control group，model group，Rosiglitazone group and Berberine group，10 rats in each group.The normal group and the model group were given normal saline.Daily vaginal smear was performed on rats，and the estrus cycle was observed by rehman staining.The changes of blood glucose were measured by OGTT，E2，F(xiàn)SH，LH，T，INS and other indicators were detected by ELISA，and HOME-IR was calculated.HE staining and immunohistochemistry were performed in the ovary and uterus of rats.Result：Berberine could increase the PPARα，γ of endometrium，improve glucose metabolism abnormality in PCOS rats，decrease LH，T，INS level，improve the ovarian polycystic appearance and adenomyosis.Conclusion：Berberberine can cause high expression of PPARα，γ on endometrial ，restore emotional cycle，improve ovarian hormone changes，glucose metabolism and insulin resistance，and its effect is better than Rosiglitazone.

【Key words】 PCOS; BBR; PPARs; Metabolic

First-authors address：Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University，Dalian 116001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.07.001

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡期婦女常見的內(nèi)分泌疾病，排卵障礙及異常的內(nèi)分泌改變使子宮內(nèi)膜分化不良，影響胚胎植入，導(dǎo)致低妊娠率和高流產(chǎn)率[1]。此外，還影響子宮內(nèi)膜正常的周期性變化，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜可能有不同程度的增生，發(fā)展為子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險也增加[2]。常伴胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和肥胖[3]。過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs）是一種核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子，具有多種生物學(xué)效應(yīng)。可增強機體對胰島素的敏感性，促進脂肪細胞分化和脂肪生成，調(diào)節(jié)體內(nèi)糖平衡，抑制炎癥因子生成及炎癥反應(yīng)。與胰島素抵抗有著密切的關(guān)系，是胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥物（TZDs）的作用靶點[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)PPARs在人類生殖系統(tǒng)中表達，且參與卵巢雌、孕激素的合成并影響受孕，通過影響組織的重塑方式調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)生、排卵和黃體的發(fā)育，參與胚胎發(fā)育及調(diào)節(jié)胎盤功能、維持妊娠等[5]。

小檗堿（Berberine）是黃連的主要成分之一，在以往主要用于胃腸疾病。最新研究發(fā)現(xiàn)，BBR具有明顯的降糖、降血脂作用，可明顯降低2型糖尿病患者的血糖、血脂水平，改善胰島素抵抗[6-7]，療效肯定。同時發(fā)現(xiàn)BBR作為中藥單體是一種PPARα、β、γ泛激動劑[8]。研究發(fā)現(xiàn)PPARγ參與調(diào)節(jié)子宮的正常生理功能，調(diào)節(jié)類固醇激素的分泌，與胰島素抵抗相關(guān)[9]。但PPARα、β是否參與生殖功能的調(diào)節(jié)目前尚無相關(guān)研究，且PPARγ在子宮內(nèi)的調(diào)節(jié)機制不清。為此本實驗應(yīng)用BBR對PCOS大鼠模型進行治療，觀察其對PCOS大鼠子宮內(nèi)膜PPARs及內(nèi)分泌代謝的影響，為了解BBR對PPARs的調(diào)節(jié)提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 重組人胰島素注射液（北京賽生藥業(yè)有限公司）;注射用人絨毛膜促性腺激素（hCG，寧波人健藥業(yè)集團股份有限公司）;小檗堿（東北制藥）;羅格列酮（成都恒瑞制藥有限公司）;酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒購自上海朗頓生物技術(shù)有限公司;兔四步法檢測試劑盒（中杉金橋）;PPARα、β、γ抗體購自北京博奧森生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及造模 選用85日齡SD雌性大鼠40只隨機分為對照組（10只）和模型組（30只）。模型組第1～21天頸背部皮下注射INS 2.0 IU/d，生理鹽水稀釋至0.2 mL，1次/d。第11～21天，皮下注射hCG 3.0 IU/d，2次/d。以5%葡萄糖溶液替代日常飲水，正常組皮下注射生理鹽水0.2 mL/d及1%羥甲基纖維素水溶液0.5 mL灌胃1次，共計21 d，全部大鼠每周稱體重1次，每日進行陰道涂片檢查;陰道上皮細胞持續(xù)角化，提示無排卵表明大鼠模型制作成功。

1.2.2 給藥方法 造模成功后將模型組大鼠隨機分為模型對照組、羅格列酮組、小檗堿組，每組10只，每天分別給予0.9%生理鹽水5 mL、小檗堿300 mg/kg（溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液），羅格列酮200 mg/kg（溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液）灌胃。每日行陰道涂片觀察各組大鼠動情周期變化，28 d后行口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）測定大鼠各時間血糖值。

1.2.3 觀察內(nèi)容及方法 動情周期：連續(xù)2個周期陰道脫落細胞涂片，瑞氏染色觀察大鼠動情周期。OGTT試驗：大鼠禁食、不禁水12 h，以3 g/kg劑量灌服50%葡萄糖溶液，尾尖取血，血糖儀測定大鼠灌糖后 0、60及120 min的血糖值。ELISA法檢測大鼠血清E2、INS、FSH、LH及T水平，HOMA-IR=空腹血漿胰島素（μU/mL）×空腹血漿葡萄糖（mmol/L）/22.5。HE染色及免疫組化觀察大鼠卵巢及子宮形態(tài)學(xué)變化：子宮組織免疫組化，計算子宮組織PPARs的變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（x±s）表示，符合正態(tài)分布計量資料多組間比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組實驗動物陰道涂片 （1）模型組：陰道涂片無周期變化。（2）正常組：陰道涂片呈周期性變化，發(fā)情前期（陰道上皮呈膨大橢圓扁平狀）-發(fā)情期（鱗狀上皮脫落，鏡下堆疊）-發(fā)情后期（大量白細胞，少量角化上皮）-靜止期（大部分白細胞，少量較小有核扁平上皮）周期變化。（3）小檗堿組及羅格列酮治療組：動情周期變化同正常對照組。見圖1。

2.2 各組實驗動物空腹FPG、FINS、HOME-IR激素水平比較 與對照組相比，模型組FINS升高（P=0.00<0.05）;與模型組相比，小檗堿組與羅格列酮組FINS降低（P=0.00<0.05），羅格列酮組與小檗堿組FINS比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.47>0.05）。對照組與模型組FPG比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.20>0.05），與模型組相比小檗堿組與羅格列酮組FPG差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，羅格列酮組與小檗堿組組FPG比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.43>0.05）。與對照組相比，模型組HOME-IR升高（P=0.00<0.05），與模型組相比小檗堿組與羅格列酮組HOME-IR降低（P=0.00<0.05），與羅格列酮組相比小檗堿組HOME-IR降低（P=0.00<0.05）。見表1。

2.3 各組實驗動物空腹OGTT比較 與對照組相比，模型組OGTT第1、2小時血糖水平升高（P=0.01<0.05）;與模型組相比，小檗堿組、羅格列酮組OGTT第1、2小時血糖水平降低（P=0.00<0.05）;小檗堿組與羅格列酮組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.43>0.05）。見表2。

2.4 各組實驗動物空腹血清激素水平比較 與對照組、小檗堿組及羅格列酮組相比，模型組LH、T明顯升高（P=0.00<0.05）;對照組與小檗堿組LH相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.43>0.05）。與對照組相比，其余三組FSH明顯升高（P=0.00<0.05），小檗堿組和羅格列酮組之間FSH比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.58>0.05）。與對照組相比，模型組E2降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.04<0.05），小檗堿組和羅格列酮組T水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.16>0.05）。見表3。

2.5 HE染色結(jié)果 （1）模型組：卵巢組織鏡下見多個卵泡，呈不規(guī)則囊性擴張狀且囊狀范圍大，占整個標本1/3～1/2面積大小。囊內(nèi)未見卵母細胞及間質(zhì)腺，卵泡周圍顆粒細胞層數(shù)減少，從1到3層分布不等，顆粒細胞數(shù)量也隨之降低，正常發(fā)育的卵泡減少，子宮組織間腺體增加。（2）羅格列酮及小檗堿治療組：卵巢未見明顯卵泡囊性擴張，鏡下可見多個各階段卵泡，呈從小到大分布。卵泡周圍顆粒細胞逐層分布，顆粒細胞層數(shù)4～7層不等，可見卵丘不規(guī)則分布于卵泡中，子宮形態(tài)基本正常。見圖2、3。

2.6 免疫組化結(jié)果 （1）與對照組相比模型組PPARα表達下降（P=0.00<0.05），與羅格列酮組和模型組相比小檗堿組PPARα升高（P=0.00<0.05），與模型組相比羅格列酮組PPARα升高（P=0.00<0.05）;（2）PPARβ在各組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.61>0.05）;（3）與對照組相比模型組PPARγ表達下降（P=0.00<0.05），與模型組相比小檗堿組、羅格列酮組PPARγ升高（P=0.00<0.05），與羅格列酮組相比小檗堿組PPARγ升高（P=0.04<0.05）。見表4、圖4～6。

3 討論

3.1 小檗堿對子宮內(nèi)膜PPARs的表達 PPARs在動物體內(nèi)有著廣泛的生物學(xué)作用，可調(diào)節(jié)脂類代謝、能量收支平衡以及細胞分裂分化等重要生理過程。目前對PPARγ的研究較多，其激動劑如TZDs可以增加胰島素敏感性并降低血糖，同時促進脂類存儲和脂肪形成。在2型糖尿病動物模型中，有效的選擇性的PPARγ激動劑可以改善IR并降低其血糖[10-11]。BBR為PPARs的泛激動劑，可以通過調(diào)節(jié)PPARs的表達，達到治療PCOS的目的。羅格列酮為TZDs類藥物，有研究認為是PPARγ的單激動劑，其臨床應(yīng)用副作用較大。本實驗結(jié)果顯示，BBR及羅格列酮對子宮內(nèi)膜PPARα、γ的表達均高于模型組，PPARβ表達與模型組無明顯差異，說明BBR和羅格列酮均可使子宮內(nèi)膜PPARα、γ呈現(xiàn)高表達。

3.2 小檗堿對生殖內(nèi)分泌與代謝的影響 BBR是從傳統(tǒng)中藥黃連根莖中提取的異喹啉類生物堿。近年來研究表明，BBR除具有傳統(tǒng)胃腸藥的作用外，還能夠改善IR，降低血糖、血脂，增加胰島素敏感性而用于2型糖尿病的治療，且無明顯不良反應(yīng)[6-7]。BBR的作用特點和羅格列酮類似，屬胰島素增敏劑，臨床可用于糖耐量異常和輕度高血糖患者[12]，相關(guān)實驗研究表明BBR可明顯改善糖尿病患者的IR情況[13]，并且筆者前期通過臨床試驗，比較BBR及二甲雙胍對PCOS患者的療效，BBR的效果顯著，并且副作用小[14]。有研究發(fā)現(xiàn)BBR能改善PCOS患者的向心性肥胖，調(diào)節(jié)血脂，減輕體重，改善慢性炎癥[15-16]。本研究結(jié)果顯示，BBR較好的改善大鼠IR，調(diào)節(jié)糖耐量異常，恢復(fù)其動情周期，改善卵巢多囊狀態(tài)及子宮腺肌癥樣表現(xiàn)的作用。

3.3 胰島素抵抗與PPARs的相關(guān)性 PPARs與胰島素抵抗有著密切的關(guān)系，是胰島素增敏劑的作用靶點。噻唑烷二酮類可通過激活胰島素受體亞單位上的酪氨酸激酶，使酪氨酸磷酸化，從而改善IR，降低胰島素水平，提高PCOS患者排卵率，改善月經(jīng)紊亂，增加妊娠機會[17]。目前，基于PPARs結(jié)構(gòu)設(shè)計治療胰島素抵抗的西藥主要是噻唑烷二酮類，但可引起肥胖、水腫，少量肝毒性等不良反應(yīng)[18]，不能大量及長期用于臨床。近年來，研究發(fā)現(xiàn)很多中藥活性成分可以激活PPARs靶點，從而改善IR[19-20]，降低PPARγ單激動劑的副作用。本次實驗顯示，BBR可以通過調(diào)節(jié)PPARα、γ的表達，改善IR，進而改善大鼠的生殖功能。BBR治療后，陰道涂片發(fā)現(xiàn)大鼠恢復(fù)了其規(guī)律的動情周期，高LH水平亦有明顯降低，黃體數(shù)目增多，各級卵泡數(shù)目增多，子宮腺肌癥樣表現(xiàn)明顯改善，大鼠整體內(nèi)分泌功能趨于正常，進而使卵巢及子宮形態(tài)學(xué)趨于正常，使大鼠恢復(fù)規(guī)律的動情周期及排卵。BBR組與羅格列酮組相比INS和HOME-IR降低（P<0.05），說明BBR在改善IR的作用上優(yōu)于羅格列酮。

綜上所述，BBR可使子宮內(nèi)膜PPARα、γ高表達，改善PCOS大鼠內(nèi)分泌代謝異常，降低T及LH水平，改善大鼠內(nèi)分泌失調(diào)狀態(tài)及卵巢和子宮形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，在改善IR方面優(yōu)于羅格列酮。但其是通過哪種途徑和機制調(diào)節(jié)PPARα、γ的仍需進一步研究。

參考文獻

[1]龔斐，郭慧，彭炬，等.改良超長方案改善多囊卵巢綜合征（PCOS）不孕患者子宮內(nèi)膜容受性的研究[J].生殖與避孕，2015，35（5）：300-309.

[2] Harding J L，Shaw J E，Peeters A，et al.Cancer risk among people with type 1 and type 2 diabetes：disentangling true associations，detectionbias，and reverse causation[J].Diabetes Care，2015，38（4）：734-735.

[3]謝幸，茍文麗.婦產(chǎn)科學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：358.

[4]姜慧潔，張曉靜，張慧，等.基于PPARs靶標改善胰島素抵抗的中藥活性成分研究進展[J].中國中藥雜志，2015，40（22）：4355-4358.

[5]龔華云，李宗河，范小艷，等.新型PPAR-δ激動劑對SD大鼠生育力與早期胚胎發(fā)育毒性研究[J].國外醫(yī)藥（抗生素分冊），2015，36（5）：216-222.

[6]張青，李琰，陳磊.黃連素對2型糖尿病及其并發(fā)癥的治療作用及相關(guān)機制研究進展[J].中國中藥雜志，2015，40（9）：1660-1665.

[7]李騁，何金枝，周學(xué)東，等.黃連素調(diào)控胰島素抵抗相關(guān)2型糖尿病的研究進展[J].中國中藥雜志，2017，42（12）：2254-2260.

[8]龐雨濃，梁英文，王玉剛，等.小檗堿通過調(diào)節(jié)PPARγ啟動子甲基化對缺血再灌注腦損傷的作用（英文）[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2018（3）：170-182.

[9] Bogacka I，Kurzynska A，Bogacki M.Peroxisome proliferator activated receptors in the regulationof female reproductive functions[J].Folia Histochem Cytobiol，2015，53（3），189-200.

[10] Vergotine Z，Yako Y，Kengne A，et al.Proliferator-activated receptor gamma Pro12Ala interacts with the insulin receptor substrate 1 Gly972Arg and increase the risk of insulin resistance and diabetesin the mixed ancestry population from South Africa[J].BMC Genet，2014，15（21）：10.

[11]魏楓.PPARr激動劑對2型糖尿病SD大鼠的防治作用及對其心肝胰腎PPARr表達的影響[A].中華醫(yī)學(xué)會、中華醫(yī)學(xué)會內(nèi)分泌學(xué)分會.中華醫(yī)學(xué)會第十次全國內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C].中華醫(yī)學(xué)會、中華醫(yī)學(xué)會內(nèi)分泌學(xué)分會，2011：2.

[12] Jiang S J，Dong H，Li J B，et al.Berberine inhibits hepatic gluconeogenesis via the LKB1-AMPK-TORC2 signaling pathway in streptozotocin-induced diabetic rats[J].World J Gastroenterol，2015，21（25）：7777-7785.

[13] Stepto N K，Cassar S，Joham A E，et al.Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp[J].Human Reproduction，2013，28（3）：777-784.

[14] Wei W，Zhao H，Wang A，et al.A clinical study on the short term effect of berberine in comparison to metformin on the metabolic characteristics of women with polycystic ovary syndrome[J].European Journal of Endocrinology，2012，166（1）：99-105.

[15] Ma H L，Gao J S，Tian F，et al.Effect of Letrozole，Berberine，or Their Combination for Infertility in Women with Polycystic Ovary Syndrome：Statistical Analysis Plan for a Multicenter Randomized Controlled Trial[J].World Journal of Traditional Chinese Medicine，2016，2（3）：36-42.

[16] José M，Aldrighi M D，Jeane M，et al.Effects of Insulin Resistance on Myocardial Blood Flow and Arterial Peripheral Circulation in Patients with Polycystic Ovary Syndrome[J].Echocardiography，2015，32（8）：1277-1284.

[17]楊志平.達英-35聯(lián)合二甲雙胍治療多囊卵巢綜合征對激素、胰島素抵抗的影響[J].中國婦幼保健，2016，31（5）：1015-1017.

[18] Soccio R E，Chen E R，Lazar M A.Thiazolidinediones and thepromise of insulin sensitization in type 2 diabetes[J].Cell Metab，2014，20（4）：573-591.

[19]涂珺，羅新新，李冰濤，等.小檗堿對脂肪胰島素抵抗細胞PPARγ及脂肪分泌因子表達的影響[J].中國中藥雜志，2016，41（11）：1983-1989.

[20]張秀紅，宣姣，亓志剛.PPARα，γ和δ：胰島素抵抗治療的靶點[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2014，30（6）：543-548.

（收稿日期：2018-09-11） ?（本文編輯：周亞杰）