阿薩希毛孢子菌體外亞硫酸氫鈉甲萘醌抗氧化誘導(dǎo)及對(duì)其形態(tài)學(xué)影響的研究

李海濤，歐敏儀，敖俊紅，楊蓉婭，祝 賀

近30年來，由于廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素、抗腫瘤藥的廣泛使用，以及器官移植、放化療、導(dǎo)管插管等技術(shù)的普遍應(yīng)用，真菌感染大幅增加，深部真菌感染已成為住院患者死亡的主要原因之一[1,2]。阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T.asahii）是毛孢子菌屬中最重要的臨床致病菌，可引起皮膚感染、夏季超敏性肺炎和深部感染，特別是播散性深部感染，病死率達(dá)80%以上[3-6]，且該菌對(duì)臨床常見的抗真菌藥物如卡泊芬凈、兩性霉素B、氟康唑等均耐藥[7-9]。目前為止，該菌的感染致病機(jī)制尚不明確，因此需要探索T.asahii的感染和致病機(jī)制、研發(fā)新的抗真菌藥物。

病原體的抗氧化機(jī)制與其致病性密切相關(guān)，這一點(diǎn)不僅在細(xì)菌[10]，在釀酒酵母、念珠菌、煙曲霉、隱球菌等常見致病真菌的研究中已經(jīng)得到證實(shí)[11-13]。在本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)H2O2（hydrogen peroxide）、二酰胺、甲萘醌可對(duì)T.asahii可產(chǎn)生不同程度的氧化殺傷作用，其中甲萘醌的殺傷作用最強(qiáng)[14]。Zhang等[15]發(fā)現(xiàn)不同來源T.asahii的過氧化氫酶（catalase，CAT）和總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性不同，這些結(jié)果表明T.asahii與其他真菌一樣，也具有抗氧化機(jī)制。為了進(jìn)一步研究其抗氧化機(jī)制，需要獲得穩(wěn)定的抗氧化菌株。當(dāng)細(xì)胞暴露于相對(duì)溫和、亞致死脅迫刺激后會(huì)對(duì)隨后的致死性脅迫刺激產(chǎn)生耐受，這種現(xiàn)象不但出現(xiàn)在細(xì)菌中，而且也發(fā)生在真核生物中，該現(xiàn)象被稱為適應(yīng)[16]?；谶@一原理，筆者參考真菌耐藥誘導(dǎo)的方法，用亞硫酸氫鈉甲萘醌（menadione sodium bisulfite，MSB）對(duì)T.asahii的臨床株和環(huán)境株進(jìn)行體外抗氧化誘導(dǎo)，并進(jìn)一步研究誘導(dǎo)前后菌株生物學(xué)特性的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

T.asahii共2株，T.asahii臨床標(biāo)準(zhǔn)株CBS 2479、環(huán)境株CBS 8904均購自荷蘭皇家藝術(shù)與科學(xué)學(xué)院真菌多樣性研究中心（CBS-Knaw）。 藥敏質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)株：近平滑念珠菌ATCC22019，由北京大學(xué)第一醫(yī)院真菌研究中心惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑與儀器

PDA干粉培養(yǎng)基（德國默克公司），蛋白胨干粉和葡萄糖干粉（北京化學(xué)試劑有限公司），酵母粉（英國Oxoid公司），MSB（美國Sigma公司），RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），三氮嗎啡琳丙磺酸（MOPS，美國Sigma公司），總蛋白定量測定盒（微板法）、CAT測定試劑盒（可見光法）、SOD測定試劑盒（WST-1 法）（南京建成生物工程研究所）。

1.3 方法

1.3.1 MSB體外誘導(dǎo)T.asahii制備經(jīng)傳代純化的單克隆T.asahiiCBS 2479、CBS 8904菌懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整濃度為1～5×106CFU/ml，取100 μl菌懸液加入10 ml不含MSB的YPD培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)10 h后加入MSB使藥物濃度達(dá)8 μg/ml（CBS 2479、CBS 8904菌株的1/2MIC MSB）后繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)菌液達(dá)到約0.5 U（麥?zhǔn)希﹩挝粫r(shí)轉(zhuǎn)至同一藥液濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每一濃度梯度轉(zhuǎn)種2～3次后再取0.5 U（麥?zhǔn)希﹩挝痪?00 μl～10 ml含1/2MIC 濃度MSB的YPD液體中培養(yǎng)10 h后再加入MSB使之達(dá)最小抑菌濃度（MIC），當(dāng)培養(yǎng)菌液達(dá)到約0.5 U（麥?zhǔn)希﹩挝粫r(shí)轉(zhuǎn)至同一藥液濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每一濃度梯度轉(zhuǎn)種2～3次。如此類推，直至菌株被殺死不再生長，即終止誘導(dǎo)。

對(duì)誘導(dǎo)第2代、誘導(dǎo)第4代的菌株檢測總蛋白濃度、CAT、SOD，并行氟康唑、MSB的MIC值測定。將所得菌株以40%甘油保存于-80℃中。

1.3.2 MSB誘導(dǎo)菌株的回復(fù)性研究 選用32 μg/ml濃度MSB誘導(dǎo)所得的菌株（即誘導(dǎo)第4代）在不含氧化劑的YPD液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代10次。對(duì)回復(fù)第2、5、8、10代的菌株檢測總蛋白濃度、CAT、SOD，并行氟康唑和MSB的MIC值測定。將所得菌株以40%甘油保存于-80℃中。

1.3.3 MSB誘導(dǎo)前后T.asahii抗氧化酶活性測定 菌株用細(xì)胞計(jì)數(shù)板配成麥?zhǔn)媳葷岫葹?.5的菌懸液，取1 ml加到50 ml YPD液體中，37℃振蕩培養(yǎng)48 h（150 r/min）。培養(yǎng)所得菌液用離心機(jī)（20℃，3 500 g，10 min）離心，棄去上層培養(yǎng)液，取下層細(xì)胞沉淀，無菌水沖洗混勻再離心，重復(fù)3次。加入約200 μl裂解緩沖液（磷酸鉀50 mmol/L，pH7.0）并混勻，將菌液轉(zhuǎn)到含有0.5 g直徑425～600 μm玻璃微珠的小EP管中再懸浮。將混懸液在Fastprep核酸提取儀中以4.0 m/s 的速度強(qiáng)振蕩20 s，冰上冷卻3～5 min，再強(qiáng)振蕩20 s，重復(fù)6次。最后1次冰上冷卻后，離心機(jī)分離（4℃，16 000 g，10 min），取上層清液用于酶活性的分析。

1.3.4 BCA法測定蛋白質(zhì)濃度

用標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白作對(duì)照。用CAT測定試劑盒和SOD測試盒分別測定CAT和SOD活性，具體操作方法按照說明書進(jìn)行。重復(fù)2～4遍。

1.3.5 形態(tài)學(xué)變化觀察 取誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)第4代、回復(fù)第10代的2479和8904菌株進(jìn)行肉眼形態(tài)和光鏡下形態(tài)學(xué)觀察。①肉眼形態(tài)： 制備 1×105cfu/ml濃度的T.asahii菌懸液，取5 μl菌懸液接種到固體 PDA培養(yǎng)基上；37 ℃培養(yǎng) 7 d后觀察菌落生長情況。②光鏡形態(tài)：制備1×106cfu/ml 濃度的T.asahii菌懸液。分別取 0.5 ml 菌懸液接種于 10 ml YPD 培養(yǎng)基中；37℃、150 r/min 搖床培養(yǎng) 72 h，取少量菌液，乳酸酚棉藍(lán)染色后光鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析，兩組間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSB誘導(dǎo)前后T.asahii抗氧化酶活性變化

CBS 2479誘導(dǎo)前CAT值為46.89 U/mgprot，經(jīng)MSB誘導(dǎo)后、回復(fù)后CAT均值分別為（150.36±62.49）、（82.35±21.13）U/mgprot。CAT 值 經(jīng) MSB誘導(dǎo)后比誘導(dǎo)前升高，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），回復(fù)后比誘導(dǎo)前升高，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），回復(fù)后比誘導(dǎo)末期下降，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。CBS 8904誘導(dǎo)前CAT值44.06 U/mgprot，經(jīng)MSB誘導(dǎo)后、回復(fù)后，CAT 值分別為（109.69±39.80）、（83.30±6.96）U/mgprot。誘導(dǎo)后的CAT酶活性比誘導(dǎo)前升高，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；回復(fù)后比誘導(dǎo)前升高，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；回復(fù)后比誘導(dǎo)末期下降，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1，圖1，圖2）。

表1 MSB誘導(dǎo)前后T.asahii菌株的抗氧化酶活性

圖1 MSB誘導(dǎo)前后T.asahi的CAT變化

圖2 MSB誘導(dǎo)前后T.asahi的CAT變化

CBS 2479誘導(dǎo)前SOD值為178.54 U/mgprot，SOD值經(jīng)MSB誘導(dǎo)后、回復(fù)后分別為（500.30±181.13）、（577.58±63.71）U/mgprot。SOD 酶 活 性經(jīng)MSB誘導(dǎo)后比誘導(dǎo)前升高，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；回復(fù)后比誘導(dǎo)前升高，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；回復(fù)后與誘導(dǎo)末期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CBS8904誘導(dǎo)前SOD值為226.70 U/mgprot，經(jīng)MSB誘導(dǎo)后、回復(fù)后，SOD值 分 別 為（640.65±195.60）、（719.70±48.23）U/mgprot，誘導(dǎo)后比誘導(dǎo)前升高，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），回復(fù)后比誘導(dǎo)前升高，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），回復(fù)后比誘導(dǎo)末期下降，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3，圖4）。

圖3 MSB誘導(dǎo)前后T.asahi的SOD變化

圖4 MSB誘導(dǎo)前后T.asahi的SOD變化

2.2 MSB誘導(dǎo)前后T.asahii形態(tài)學(xué)變化

2.2.1 肉眼形態(tài) 各菌株在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，觀察可見CBS 2479誘導(dǎo)前乳白色菌落呈放射狀，菌落輪廓呈圓形，中央有多量不規(guī)則皺褶，堆積呈珊瑚狀；經(jīng)MSB誘導(dǎo)后，菌落輪廓呈不規(guī)則形，菌落中央不規(guī)則皺褶明細(xì)變短變少，局部像破了的水皰；回復(fù)實(shí)驗(yàn)后，菌落輪廓仍呈不規(guī)則形，中央不規(guī)則皺褶與誘導(dǎo)末差異不大，CBS 2479-MSB回復(fù)菌株中央的不規(guī)則皺褶仍短而少（圖5）。

圖5 MSB誘導(dǎo)、回復(fù)前后T.asahii菌落形態(tài)變化

CBS 8904誘導(dǎo)前菌落輪廓呈不規(guī)則形，中央有少量較大的溝回，表面顆粒狀凸起，邊緣呈花瓣?duì)?；?jīng)MSB誘導(dǎo)后，菌落輪廓呈類圓形，中央溝回變小、數(shù)量顯著增多，顆粒狀凸起增多，菌落中央出現(xiàn)大量不規(guī)則皺褶，邊緣整齊；回復(fù)后，菌落輪廓呈圓形，菌落中央出現(xiàn)呈同心圓樣的輻射狀輪紋，中央出現(xiàn)較多不規(guī)則皺褶，邊緣整齊（圖6）。

圖 6 MSB誘導(dǎo)、回復(fù)前后T.asahii光鏡下形態(tài)變化

2.2.2 光鏡下形態(tài)

CBS 2479菌株誘導(dǎo)前以菌絲為主，MSB誘導(dǎo)末菌絲明顯減少變短，出現(xiàn)較多假菌絲，與孢子混合分布，回復(fù)末仍可見少量假菌絲混合在孢子中。CBS 8904菌株誘導(dǎo)前幾乎全為孢子狀態(tài)，MSB誘導(dǎo)末以假菌絲為主，僅有少量孢子，回復(fù)末仍可見大量假菌絲，中間散在分布少量孢子（圖6）。

3 討論

病原體（包括細(xì)菌、真菌和病毒等）侵入機(jī)體后，誘導(dǎo)機(jī)體進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)，釋放大量活性氧遞質(zhì)（reactive oxygen，ROS）來殺滅病原體。ROS主要包括過氧化氫、超氧陰離子、羥自由基、過氧化物等[17]，ROS 的殺傷力非常強(qiáng)，幾乎能破壞所有的生物分子，包括所有病原體[18]，如細(xì)菌、真菌、病毒等。ROS主要通過與細(xì)胞內(nèi)成分如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA 等發(fā)生反應(yīng)，使細(xì)胞嚴(yán)重破壞，引起細(xì)胞死亡。而病原體為了生存，會(huì)啟動(dòng)自身的一系列抗氧化機(jī)制，來對(duì)抗機(jī)體的氧化殺傷，為它們的侵襲感染和致病創(chuàng)造條件。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，常用的3種氧化劑中，甲萘醌對(duì)T.asahii的氧化殺傷作用最強(qiáng)[14]。因此，本研究首次應(yīng)用甲萘醌體外誘導(dǎo)T.asahii，以期獲得T.asahii抗甲萘醌菌株，并觀察誘導(dǎo)前后菌株的生物學(xué)特性變化，為下一步抗氧化機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MSB誘導(dǎo)后，CBS 2479和CBS 8904的抗氧化酶活性均升高。CBS 2479誘導(dǎo)第4代（即誘導(dǎo)末）CAT值較誘導(dǎo)前升高了4.36倍，而CBS 8904誘導(dǎo)第4代（即誘導(dǎo)末）CAT值則較誘導(dǎo)前升高了3.27倍；CBS 2479誘導(dǎo)第4代（即誘導(dǎo)末）SOD值較誘導(dǎo)前升高了3.68倍，而CBS 8904誘導(dǎo)第4代（即誘導(dǎo)末）SOD值較誘導(dǎo)前升高了3.57倍。本研究結(jié)果表明，MSB在體外可以成功誘導(dǎo)T.asahii，并可激活或誘導(dǎo)抗氧化酶活性，使T.asahii的抗氧化能力顯著提高，從而不被宿主免疫系統(tǒng)釋放的ROS殺死，為其今后感染宿主奠定重要基礎(chǔ)。

CBS 2479和CBS 8904回復(fù)后，它們的抗氧化酶活性均較誘導(dǎo)末明顯下降，但是仍高于誘導(dǎo)前。CBS 2479回復(fù)末CAT值較誘導(dǎo)末下降了3.6倍（P＜0.05），而CBS 2479回復(fù)末SOD值則較誘導(dǎo)末僅下降了1.3倍。CBS 8049回復(fù)末CAT值較誘導(dǎo)末下降了1.8倍，而CBS 8904回復(fù)末SOD值則較誘導(dǎo)末僅下降了1.1倍。提示當(dāng)去除MSB暴露后，菌株的SOD、CAT值逐漸下降，說明菌株的CAT和SOD的誘導(dǎo)具有可調(diào)節(jié)性。本研究發(fā)現(xiàn)，CBS 2479回復(fù)末的抗氧化酶活性較誘導(dǎo)末顯著下降，其CAT值幾乎回復(fù)到誘導(dǎo)前水平，而CBS 8904回復(fù)末較誘導(dǎo)末有下降，不如CBS 2479明顯，但與誘導(dǎo)前比，仍高1.8倍，提示CBS 2479對(duì)MSB干預(yù)后可調(diào)節(jié)性較強(qiáng)，而CBS 8904對(duì)MSB干預(yù)后可調(diào)節(jié)性相對(duì)較弱。筆者分析，臨床分離株CBS 2479由于之前曾與機(jī)體免疫系統(tǒng)等相互作用后激活了其抗氧化能力，因此其抗氧化能力的可調(diào)節(jié)性較強(qiáng)；而環(huán)境分離株CBS 8904未曾進(jìn)入機(jī)體，其抗氧化能力未被激活，因此其抗氧化調(diào)節(jié)能力相對(duì)較弱。

為了生存，真菌常通過形態(tài)轉(zhuǎn)換逃避有害因素的刺激，真菌形態(tài)轉(zhuǎn)換是其重要的毒力或致病因素。本研究發(fā)現(xiàn)，CBS 2479和CBS 8904誘導(dǎo)前后其菌落形狀、菌落上溝回或皺褶的形狀、數(shù)量以及菌落的質(zhì)地發(fā)生較明顯變化，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)其菌絲、孢子之間出現(xiàn)相互轉(zhuǎn)換。筆者分析認(rèn)為，在MSB的干預(yù)下，T.asahii為了生存，進(jìn)行形態(tài)轉(zhuǎn)換來應(yīng)對(duì)這種有害刺激。因此，T.asahii在氧化劑MSB的干預(yù)下發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)換，不僅是其為了逃避有害因素刺激，而且其毒力或致病性也將發(fā)生了變化，為其今后感染宿主創(chuàng)造了重要條件。

總之，筆者通過在體外用MSB對(duì)T.asahii的臨床標(biāo)準(zhǔn)株和環(huán)境株進(jìn)行抗氧化誘導(dǎo)，成功誘導(dǎo)出抗氧化菌株，并對(duì)抗氧化菌株的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，同時(shí)觀察了MSB對(duì)T.asahii的臨床標(biāo)準(zhǔn)株和環(huán)境株形態(tài)學(xué)的影響。本研究為今后阿薩希毛孢子菌感染的抗氧化機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，也為T.asahii抗氧化機(jī)制的后續(xù)研究奠定了重要基礎(chǔ)。