三種不同品種的蠶繭絲膠抗氧化活性的研究

李 彪，李曉慧，邵 輝*

(中科國(guó)思生物科技研究(廣州)有限公司，廣東 廣州 511453)

蠶絲是人類最早利用的天然蛋白質(zhì)之一，享有“纖維皇后”的美譽(yù)[1]。目前，我國(guó)是世界上家蠶蠶絲及柞蠶絲產(chǎn)量最大的國(guó)家，家蠶生絲產(chǎn)量約占世界一半[2]。蠶絲蛋白質(zhì)含量高達(dá)98%，主要由絲素蛋白和絲膠蛋白兩部分組成，其中絲素蛋白占70%～80%，絲膠蛋白占20%～30%。絲膠中含有人體所必需的氨基酸，其含量高達(dá) 17% 以上，而在組成絲膠的 18 種氨基酸中有 8種是人體必需的氨基酸[3]。

有關(guān)研究表明，分子量大的絲膠肽可用于合成纖維、皮革等材料的表面改性，有效防止了化學(xué)材料對(duì)皮膚的直接傷害，可以廣泛用于床上用品、貼身衣物、人造皮革類護(hù)墊等商品；同樣，絲膠還可以與其他高分子材料混合制成功能性、可降解性的高分子材料，如人造骨釘[4-5]、人造皮膚[6-7]、疫苗保護(hù)載體[8]等；小分子量的絲膠水解物可以用于護(hù)膚品的制作[9]，比如免洗面膜、潔面乳、潤(rùn)膚霜、沐浴露等，還可以用作功能性的食品、飲料[10]等方面。

但是在繅絲廠、絲織廠、絲綢煉染廠等進(jìn)行繅絲、煉染等加工過(guò)程中需要不同程度的脫膠處理；在絲綿廠、絹紡廠等機(jī)構(gòu)，必須完全或部分脫去絲膠才可以進(jìn)行后續(xù)的加工處理，而絲膠水則作為廢水、污水排放出去，則造成了大量的資源浪費(fèi)及環(huán)境污染，因此有效回收和綜合利用各種絲膠肽及其水解物具有重要的研究和開(kāi)發(fā)價(jià)值。本文重點(diǎn)討論了三種不同品種的絲膠蛋白抗氧化活性，為絲膠在護(hù)膚品、保健食品等領(lǐng)域的利用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料、試劑和儀器

三種家蠶品種：黃繭、綠繭、白繭

主要試劑：1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH自由基)、VC(分析純≥99.7%)、VE上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；無(wú)水乙醇 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

主要儀器：紫外可見(jiàn)光光度計(jì)(UV2800S) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，高壓蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，電子精密天平PL203 梅特勒-托利多儀器有限公司，HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇科析儀器有限公司

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高溫高壓脫膠法制備蠶絲膠原液

將蠶絲洗凈，去除雜質(zhì)，置于110℃～120℃高壓蒸汽滅菌器中蒸煮2小時(shí)，取出脫膠后的生絲用熱水反復(fù)沖洗，合并沖洗液和脫膠液，使用多層紗布網(wǎng)過(guò)濾，除去雜質(zhì)與不溶物，將濾液置于零下40℃中冷凍，取出后置于常溫下解凍，收集絲膠絮狀物，然后微波干燥，打粉，即得到水溶性的絲膠蛋白粉末。

1.2.2 絲膠蛋白的抗氧化測(cè)定方法

絲膠蛋白的抗氧化效果可以通過(guò)對(duì)DPPH自由基(1,1-二苯基-2-苦肼基)清除作用來(lái)指示，清除率越高，則表示該絲膠蛋白的抗氧化活性越高，清除率可以按照下列公式計(jì)算[11]：

其中A0、A1、A2是以無(wú)水乙醇做空白對(duì)照，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定的吸光度，每一組吸光度值平行測(cè)3次，取平均值。

式中：A0為X ml 0.0256g/L DPPH自由基溶液+X ml去離子水

A1為X ml 0.0256g/L DPPH自由基溶液+X ml絲膠溶液(反應(yīng)30min)

A2為Xml無(wú)水乙醇+X ml絲膠溶液(反應(yīng)30 min)

1.2.3 絲膠蛋白清除DPPH自由基的測(cè)定方法

準(zhǔn)確稱取DPPH自由基試劑0.0256 g，用無(wú)水乙醇為溶劑配制質(zhì)量濃度為0.256g/L的DPPH自由基儲(chǔ)備液，置于冰箱中冷藏備用，使用前用無(wú)水乙醇稀釋成0.0256 g/L。

在試管中分別吸入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL和10.0 mL用無(wú)水乙醇稀釋10倍的DPPH自由基標(biāo)準(zhǔn)溶液，不足10 mL的用無(wú)水乙醇補(bǔ)齊。以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各溶液的吸光度，得到DPPH自由基溶液吸光度與質(zhì)量濃度關(guān)系曲線的回歸方程：y=0.067x-0.0031(R2=0.9998)。DPPH自由基溶液的質(zhì)量濃度與吸光度之間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，說(shuō)明DPPH自由基溶液的吸光度在一定范圍內(nèi)可以表示溶液中DPPH自由基質(zhì)量濃度的大小[11]。

三種絲膠蛋白分別配制成不同濃度待測(cè)液，吸取4毫升待測(cè)液，加入4毫升DPPH自由基溶液，混勻后反應(yīng)30分鐘，測(cè)定517 nm處吸光值，以無(wú)水乙醇為對(duì)照。

為了能更好的說(shuō)明三種絲膠清除DPPH自由基的效果，本實(shí)驗(yàn)中采用抗氧化能力較強(qiáng)的維生素C與維生素E作為對(duì)照，更好的評(píng)價(jià)這三種絲膠蛋白的抗氧化能力。

2 結(jié)果分析

2.1 維生素C與維生素E對(duì)DPPH自由基的清除率

如圖1所示，分別為VC與VE對(duì)DPPH自由基的清除率。

圖1 VC與VE的DPPH自由基清除率的關(guān)系曲線Fig.1 DPPH free radical scavenging rates of VC and VE

由圖1可知，購(gòu)買來(lái)的VC與VE標(biāo)準(zhǔn)品都能夠有效地清除DPPH自由基，且隨著兩者濃度的升高，清除率也逐漸增大，但當(dāng)VC和VE的濃度達(dá)到一定值之后，該清除率就趨于穩(wěn)定，幾乎不再增加。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)VC濃度在小于50 mg/L時(shí)，VE濃度在小于60 mg/L時(shí)，兩種抗氧化劑對(duì)DPPH自由基的清除率之間呈現(xiàn)近似線性關(guān)系，并通過(guò)該線性方程可以計(jì)算出VC和VE的IC50值，其值如表1所示。

2.2 三種蠶繭絲膠對(duì)DPPH自由基的清除率

如圖2所示，分別為黃繭、綠繭、白繭三種繭絲膠對(duì)DPPH自由基的清除率。

從圖2可知，黃繭、綠繭和白繭三種繭絲膠均對(duì)自由基有較強(qiáng)的清除率，且隨著絲膠濃度的增加而增大，并且三種絲膠在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)自由基的清除率呈現(xiàn)出近似的線性關(guān)系，由此可以計(jì)算出三種絲膠的IC50，并如表1所示。

從表1可知，當(dāng)DPPH自由基清除率達(dá)到50%時(shí)，綠繭濃度為3.38 g/L，白繭濃度為5.39 g/L，黃繭濃度為6.28 g/L就可以達(dá)到濃度為27.87 mg/L的VC和濃度為41.47 mg/L的VE等同的抗氧化效果，可見(jiàn)三種絲膠的抗氧化效果絕佳。再由圖3和表1可知，三種絲膠對(duì)DPPH自由基清除的能力大小為：綠繭〉白繭〉黃繭，可見(jiàn)，綠繭在三種不同顏色品種中的抗氧化能力最強(qiáng)。蠶繭的顏色由桑葉中胡蘿卜色素和類黃酮色素決定的，蠶類消化桑葉，桑葉中的類黃酮色素被蠶體內(nèi)的多種代謝系統(tǒng)轉(zhuǎn)化并最終表現(xiàn)在蠶的繭殼上，而繭殼的顏色多集中在絲膠中，可見(jiàn)，綠繭品種的桑蠶在結(jié)繭過(guò)程中分泌出來(lái)的類黃酮色素含量比較多，故綠繭的抗氧化活性最強(qiáng)。這與陳復(fù)生博士[12]利用多種顏色品種的蠶繭絲膠清除羥基自由基和去除超氧自由基得出來(lái)的抗氧化結(jié)論相一致。

圖2 三種不同繭的DPPH自由基清除率的關(guān)系曲線Fig.2 DPPH free radical scavenging rates of three different sericin

試樣線性方程R2IC50VCy=1.9629x-4.7070.996127.87 mg/LVEy=1.406x-8.3050.99841.47 mg/L綠繭y=132.77x+5.0650.98993.38 g/L白繭y=96.021x-1.7460.99375.39 g/L黃繭y=90.254x-6.7050.99586.28 g/L

3 結(jié)論

三種不同顏色的絲膠蛋白與VC和VE通過(guò)對(duì)DPPH自由基的清除率對(duì)比來(lái)表達(dá)它們的抗氧化能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，綠繭、白繭、黃繭的IC50分別為3.38 g/L、5.39 g/L、6.28 g/L，作為一種原料來(lái)說(shuō)，在其濃度這么小的情況下就等同于VC標(biāo)準(zhǔn)品濃度在27.87 mg/L與VE標(biāo)準(zhǔn)品濃度在41.47 mg/L時(shí)的抗氧化效果，尤其是綠繭抗氧化效果最好，可見(jiàn)其作為化妝品、醫(yī)療用品的原料是具有很大的市場(chǎng)空間的。同時(shí)絲膠蛋白自身固有的凝膠特性、無(wú)毒、無(wú)污染、可生物降解等活性，其中含有的人體所需的8種必需氨基酸，而脂肪和碳水化合物含量極少，這又極大地符合了人類現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)方面的要求，作為“21世紀(jì)的高科技食品”[13]，它正在從原來(lái)的蠶繭廢料資源轉(zhuǎn)身一變通過(guò)食品、保健品的途徑進(jìn)入我們的生活。