腺樣體肥大伴分泌性中耳炎患兒的免疫功能分析

董 萍，姜立波

(1.舟山市婦幼保健院耳鼻喉科，浙江 舟山 316100；2.舟山市定海區(qū)中心醫(yī)院耳鼻喉科，浙江 舟山 316000)

分泌性中耳炎(secretory otitis media，SOM)是兒童常見(jiàn)多發(fā)病，以鼓室積液及聽(tīng)力下降為主要臨床特征，常并發(fā)于腺樣體肥大。因早期癥狀不明顯、幼兒不善表達(dá)等因素，常發(fā)生延誤就醫(yī)、漏診情況，致患兒錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)期，可能導(dǎo)致患兒出現(xiàn)聽(tīng)力不可逆下降或致聾，影響患兒的言語(yǔ)及智力發(fā)育，嚴(yán)重危害患兒的生命健康[1-2]。分泌性中耳炎的發(fā)病機(jī)制尚未明確，有研究發(fā)現(xiàn)，免疫因素可能與其發(fā)病相關(guān)[3]。腺樣體屬于鼻咽部淋巴組織的重要組成部分之一，其內(nèi)含有大量不同發(fā)育階段的淋巴細(xì)胞和炎癥細(xì)胞因子，具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能[4-5]。本研究通過(guò)比較腺樣體肥大伴SOM患兒及單純腺樣體肥大患兒腺樣體組織中的T淋巴細(xì)胞及炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)情況，探討腺樣體分泌的T淋巴細(xì)胞及炎癥細(xì)胞因子與SOM發(fā)病的相關(guān)性，具體報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2015年3月至2018年2月期間舟山市婦幼保健院和舟山市定海區(qū)中心醫(yī)院收治的單純腺樣體肥大患兒65例作為對(duì)照組，腺樣體肥大伴SOM患兒70例作為觀(guān)察組，所有研究對(duì)象的監(jiān)護(hù)人均知情同意參與本研究。所有患兒均經(jīng)鼻咽部X線(xiàn)側(cè)位片、CT檢查或纖維鼻咽內(nèi)鏡檢查等證實(shí)為腺樣體肥大，并行腺樣體切除術(shù)取腺樣體組織標(biāo)本留樣，腺樣體肥大診斷標(biāo)準(zhǔn)參照增殖腺/鼻咽腔比率(A/N比率)測(cè)定方法，以A/N比率≥0.7顯示為病理性肥大[6]，SOM以鼓室聲導(dǎo)抗圖為B型、C型或As型，CT檢查鼓室積液陽(yáng)性為診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。其中，對(duì)照組患兒男34例，女31例；年齡2～13歲，平均(7.9±2.4)歲；病程2～36月，平均(26.4±9.5)個(gè)月。觀(guān)察組患兒男37例，女33例；年齡3～14歲，平均(8.4±3.1)歲；病程3～32月，平均(28.2±10.0)個(gè)月。入組患兒均排除腺樣體機(jī)械性阻塞、鼻炎及支氣管哮喘、急性呼吸道感染、自身免疫性疾病及糖皮質(zhì)激素用藥史等因素，臨床均表現(xiàn)為睡眠打鼾、睡眠不安、張口呼吸、聽(tīng)力減退及耳鳴等。兩組患兒的性別、年齡、病程等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。

1.2免疫組化法檢測(cè)

采用免疫組化法分別檢測(cè)兩組患兒腺樣體組織中CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)量及CD4+T/CD8+T值。鼠抗人CD3、CD4、CD8單克隆抗體，SP試劑盒，DAB顯色液均購(gòu)自于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。取留樣組織標(biāo)本置10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋。免疫組化采用SP法，石蠟標(biāo)本行5μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、梯度酒精水化；以3%H2O2室溫孵育10～20min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；以0.01mol/L的構(gòu)椽酸鹽緩沖液(pH=6)微波3檔加熱5min，行抗原修復(fù)；室溫冷卻后，以0.01mol/L PBS沖洗5min×3次；以5%BSA液37℃恒溫封閉30min；加入1:80稀釋的一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日以PBS沖洗5min×3次，加入1:100稀釋的山羊抗兔IgG二抗工作液，37℃恒溫孵育20min，再以PBS沖洗5min×3次，加入1:100稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，37℃恒溫孵育20min，PBS沖洗5min×3次；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。以PBS溶液代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知陽(yáng)性高表達(dá)組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞均以胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，先在低倍視野(×100倍)下觀(guān)察免疫組化切片，選取細(xì)胞均勻分布視野，再隨機(jī)選取5個(gè)具有代表意義的高倍視野(×400倍)，以Image-pro plus6.0彩色圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，分別計(jì)數(shù)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分率反映CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)量。

1.3 ELISA法檢測(cè)

采用ELISA法分別檢測(cè)兩組患兒腺樣體組織中TNF-α、IL-2、IL-6的含量。人TNF-α、IL-2、IL-6的ELISA試劑盒均購(gòu)于上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司，應(yīng)用雙抗體夾心法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1兩組T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)量的比較

CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞在觀(guān)察組和對(duì)照組患兒的腺樣體組織中均有大量表達(dá)，表達(dá)多集中于細(xì)胞膜或包漿中，顯色為棕黃色。與對(duì)照組患兒相比，觀(guān)察組患兒腺樣體組織中的CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)量及CD4+T/CD8+T值均顯著升高，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)量的比較

2.2兩組TNF-α、IL-2、IL-6含量的比較

與對(duì)照組患兒相比，觀(guān)察組患兒腺樣體組織中TNF-α、IL-2、IL-6的含量均顯著升高，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

組別 例數(shù)(n)TNF-α(ng/L)IL-2(ng/L)IL-6(ng/L)對(duì)照組65108.62±11.23172.21±20.35126.34±13.95觀(guān)察組70146.53±18.54215.54±22.48167.86±24.74t7.2818.0357.148P<0.05<0.05<0.05

3討論

3.1兒童SOM伴發(fā)腺樣體肥大的原因分析

分泌性中耳炎好發(fā)于兒童，研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)上呼吸道感染、扁桃體發(fā)炎、鼻竇發(fā)炎、咽鼓管功能障礙及免疫功能失調(diào)均可能引起分泌性中耳炎的發(fā)作[8-9]。由于兒童SOM發(fā)作常伴發(fā)腺樣體肥大，我們分析，其一，可能是因?yàn)榉蚀蟮南贅芋w可直接壓迫咽鼓管咽口，使咽鼓管出現(xiàn)通氣功能障礙，減少耳內(nèi)空氣流通，形成負(fù)壓，從而導(dǎo)致鼓室內(nèi)出現(xiàn)積液[10]；其二，腺樣體內(nèi)含有大量的淋巴細(xì)胞和炎癥細(xì)胞因子，腺樣體肥大易導(dǎo)致腺樣體局部出現(xiàn)免疫功能失調(diào)，進(jìn)而誘發(fā)分泌性中耳炎[1]。

3.2 T淋巴細(xì)胞與SOM伴發(fā)腺樣體肥大的相關(guān)性

淋巴細(xì)胞是反應(yīng)細(xì)胞免疫的重要細(xì)胞群，可通過(guò)檢測(cè)其中T淋巴細(xì)胞亞群的水平變化對(duì)機(jī)體的免疫功能進(jìn)行監(jiān)測(cè)[11]，其中，CD3+和CD4+分別代表T淋巴細(xì)胞和輔助性T淋巴細(xì)胞，二者協(xié)同調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的作用，CD8+則代表抑制性T淋巴細(xì)胞，具有抑制機(jī)體免疫應(yīng)答和T細(xì)胞增殖的作用，CD4+與CD8+相互拮抗，共同維持免疫功能的動(dòng)態(tài)平衡[11]。眾多學(xué)者一致認(rèn)為，CD4+T/CD8+T可作為衡量患者免疫功能狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)，CD4+T/CD8+T值升高，顯示機(jī)體免疫功能增強(qiáng)，CD4+T/CD8+T值下降，則顯示機(jī)體免疫功能下降[12]。盡管腺樣體的免疫功能近年來(lái)愈發(fā)受到重視，但腺樣體中的免疫活性物質(zhì)與SOM發(fā)病的相關(guān)性，仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究比較了腺樣體肥大伴SOM患兒及單純腺樣體肥大患兒腺樣體組織中的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)情況和CD4+T/CD8+T值，結(jié)果顯示，腺樣體肥大伴SOM患兒腺樣體組織中CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)量、CD4+T/CD8+T值均顯著高于單純腺樣體肥大患兒(P<0.05)，可見(jiàn)，上述T淋巴細(xì)胞亞群均可能參與了分泌性中耳炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，該結(jié)果與Kotowski等[13]和馬桂琴等[4]的報(bào)道基本一致。

3.3炎癥細(xì)胞因子與SOM伴發(fā)腺樣體肥大的相關(guān)性

腺樣體組織肥大能夠?qū)е職獾蓝氯?，誘發(fā)機(jī)體組織細(xì)胞缺氧，進(jìn)而刺激釋放大量TNF-α、IL-2、IL-6等多種炎癥細(xì)胞因子，其水平的異常變化可影響機(jī)體的免疫和防御功能，介導(dǎo)機(jī)體發(fā)生變態(tài)反應(yīng)，導(dǎo)致滲出性中耳炎(OME)患兒病情反復(fù)，經(jīng)久不愈[14-15]，其中，IL-6具有促進(jìn)B淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)、分泌免疫球蛋白作用，能參與早期OME防御反應(yīng)[16]。本研究比較了腺樣體肥大伴SOM患兒及單純腺樣體肥大患兒腺樣體組織中TNF-α、IL-2、IL-6炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，腺樣體肥大伴SOM患兒腺樣體組織中TNF-α、IL-2、IL-6的含量均顯著高于單純腺樣體肥大患兒(P<0.05)，可見(jiàn)，上述炎癥細(xì)胞因子的大量釋放也可能是分泌性中耳炎反復(fù)發(fā)作的機(jī)制之一，該結(jié)果與白治田等[17]和劉衛(wèi)衛(wèi)等[18]的報(bào)道基本一致。

終上所述，腺樣體肥大伴SOM患兒腺樣體局部T淋巴細(xì)胞及炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)均顯著上升，可能誘導(dǎo)腺樣體局部免疫功能失調(diào)，進(jìn)而誘發(fā)SOM反復(fù)發(fā)作。