刺盤孢屬真菌PCR檢測方法的建立

李 鳳，張祥林，王 翀，羅 明

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.烏魯木齊海關(guān)技術(shù)中心，烏魯木齊 830063)

0 引 言

【研究意義】刺盤孢屬 (Colletotrichum)真菌種類多，分布廣，常引起多種植物炭疽病，為害許多農(nóng)作物、果樹、蔬菜等，影響農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量及產(chǎn)量，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的損失[1-2]。刺盤孢屬真菌中的咖啡漿果炭疽病菌主要為害小粒種咖啡，是咖啡上的一種毀滅性病害[3]。該屬在植物病原真菌中占有重要的地位?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】以往對刺盤孢屬真菌的分類鑒定主要依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行，包括分生孢子和附著胞的形態(tài)、大小，剛毛、菌核、有性型等[4]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internaltranscribedspacers，ITS)序列分析被越來越多的應(yīng)用到真菌分類鑒定中。在真核生物核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的18S rRNA(smallsubunit，SSU)和 28S rRNA(largesubunit，LSU)的基因序列較長且進(jìn)化速度慢，較為保守，可用在屬以上分類單元的系統(tǒng)學(xué)分析中[5]。陳汝等[6]對有炭疽病癥狀的紅富士果實利用rDNA-ITS 序列分析結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將病原菌鑒定為膠孢炭疽菌。李河等[7]利用形態(tài)學(xué)檢測結(jié)合多基因系統(tǒng)學(xué)方法對從油茶葉上分離的病原菌進(jìn)行鑒定，鑒定出病原菌為暹羅刺盤孢。鄧維萍等[8]對在云南省葡萄主產(chǎn)區(qū)采集的炭疽病菌菌株利用形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)合特異性引物分子檢測，明確了病原菌為膠孢炭疽菌。李海云等[9]對從大豆莖稈上分離的大豆炭疽病菌，通過菌落及分生孢子形態(tài)、病原菌的致病性及ITS與ACT序列特征，將該病原菌鑒定為Colletotrichumchlorophyti。【本研究切入點】目前對該屬真菌的研究多集中在屬間分類和病原菌的種類鑒定等方面，對該屬真菌快速檢測的報道很少。設(shè)計出檢測該屬真菌的特異性引物，建立快速檢測該屬真菌的PCR方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對刺盤孢屬及其近似屬的ITS基因序列分析，設(shè)計出能夠快速檢測刺盤孢屬的特異性引物。

1 材料與方法

1.1 材 料

研究所用的40株不同種的刺盤孢屬(Colletotrichum)真菌菌株，3株刺盤孢屬近似屬Cryptosporiopsiscaliforniae、Monochaetiakansensis、Pestalotiopsissp.菌株由中科院微生物所提供，2株Hainesialythri、Ascochytopsisvignae菌株購買自中國普通微生物菌種保藏管理中心，1株P(guān)estalotiatheaeSaw菌株購買自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，詳細(xì)的菌株名稱、寄主及來源。表1

表1 供試菌株
Table 1 The strain used in this study

序號NO.菌株 Strain 寄主 Strain 菌種來源 Source1Colletotrichum acutatum complex野茶樹Camellia sinensis中科院微生物所,編號LC34432Colletotrichum aenigma印第安魔力海棠Malus Indian Magic中科院微生物所,編號LC30343Colletotrichum alienum野茶樹Camellia sinensis中科院微生物所,編號LC31144Colletotrichum bletillum黃花白芨Bletilla ochracea中科院微生物所,編號LC23407Colletotrichum caudasporum黃花白芨Bletilla ochracea中科院微生物所,編號LC23118Colletotrichum cereale黃花白芨Bletilla ochracea中科院微生物所,編號LC23069Colletotrichum clavatum中科院微生物所,編號LC517410Colletotrichum cliviae野茶樹Camellia sinensis中科院微生物所,編號LC354611Colletotrichum coccodes番茄Lycopersicon esculentum Mill.中科院微生物所,編號LC004112Colletotrichum conoides辣椒Capsicum annuum中科院微生物所,編號LC622613Colletotrichum cordylinicola興山馬醉木Pieris formosa 中科院微生物所,編號LC068714Colletotrichum dematium吉祥草Reineckia carnea 中科院微生物所,編號LC100415Colletotrichum destructivum黃花白芨Bletilla ochracea中科院微生物所,編號LC232917Colletotrichum duyunensis黃花白芨Bletilla ochracea中科院微生物所,編號LC230718Colletotrichum endophytum黃花白芨Bletilla ochracea中科院微生物所,編號LC231819Colletotrichum excelsum-altitudum黃花白芨Bletilla ochracea中科院微生物所,編號LC234420Colletotrichum fioriniae細(xì)葉香桂Cinnamomum chingii Metcalf中科院微生物所,編號LC068921Colletotrichum fragariae中科院微生物所,編號LC057622Colletotrichum fructicola野茶樹Camellia sinensis中科院微生物所,編號LC629823Colletotrichum gloeosporioides柑橘Citrus reticulata Blanco中科院微生物所,編號LC697624Colletotrichum grossum辣椒Capsicum annuum中科院微生物所,編號LC622725Colletotrichum guizhouensis黃花白芨Bletilla ochracea中科院微生物所,編號LC230526Colletotrichum hemerocallidis萱草Hemerocallis fulva (L.) L.中科院微生物所,編號LC056027Colletotrichum henanensis野茶樹Camellia sinensis中科院微生物所,編號LC303028Colletotrichum higginsianum中科院微生物所,編號LC759529Colletotrichum horii刨花楠Machilus pauhoi中科院微生物所,編號LC071930Colletotrichum hymenocallidis中科院微生物所,編號LC003931Colletotrichum jasmini-sambac芒果Mangifera sp.中科院微生物所,編號LC015532Colletotrichum jiangxiense野茶樹Camellia sinensis中科院微生物所,編號LC346033Colletotrichum kahawae芭蕉Musa basjoo中科院微生物所,編號LC706234Colletotrichum karstii野茶樹Camellia sinensis中科院微生物所,編號LC357036Colletotrichum liriopes黃花白芨Bletilla ochracea中科院微生物所,編號LC235137Colletotrichum musae中科院微生物所,編號LC0084

續(xù)表1 供試菌株
Table 1 The strain used in this study

序號NO菌株 Strain 寄主 Strain 菌種來源 Source38Colletotrichum ochracea黃花白芨Bletilla ochracea中科院微生物所,編號LC230339Colletotrichum orchidearum中科院微生物所,編號LC004040Colletotrichum parsonsiae黃花白芨Bletilla ochracea中科院微生物所,編號LC234342Colletotrichum siamense油茶Camellia oleifera中科院微生物所,編號LC296943Colletotrichum spaethianum草grass中科院微生物所,編號LC281544Colletotrichum thailandicum咖啡Coffea中科院微生物所,編號LC013945Colletotrichum tofieldiae黃花白芨Bletilla ochracea中科院微生物所,編號LC233646Cryptosporiopsis californiae中科院微生物所,編號LC492347Monochaetia kansensis中科院微生物所,編號LC163748Pestalotiopsis sp.山茶Camellia中科院微生物所,編號LC292949Hainesia lythri紅樹 Rhizophora apiculata Bl.中國普通微生物菌種保藏管理中心,編號3.904250Ascochytopsis vignae元寶槭 Acer truncatum Bunge中國普通微生物菌種保藏管理中心,編號3.1212151Pestalotia theae Saw茶葉Tea中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心,編號ACCC 36934

主要儀器有：Retsch MM400研磨儀，Hitachi高速離心機(jī)，ND1000核酸檢測儀，ABI梯度PCR儀，TY-C型多功能電泳儀，通用凝膠成像系統(tǒng)(Intas Gel Jet Imagery)。實驗所用PCR 試劑、核酸提取試劑盒等均購于天根生化科技(北京)有限公司；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 菌絲體的收集及供試菌株基因組DNA的提取

供試菌株在PDA培養(yǎng)基上25℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d。用無菌刀片刮取PDA平板上適量菌絲放入2 mL離心管中，離心管內(nèi)放入直徑0.5 cm的鋼珠，蓋上離心管蓋子放入液氮中5 min后取出，立刻將液氮冷凍過的離心管裝在預(yù)冷過的研磨盒里并放在研磨儀上研磨30 s，將鋼珠倒出，按照北京天根生化科技有限公司新型植物基因組DNA提取試劑盒(DP305-03)說明書提取菌株基因組DNA。提取的DNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 特異性引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增

刺盤孢屬真菌的ITS基因序列參考Cannon、Damm、Weir等[10-14]，刺盤孢屬近似屬真菌的ITS基因登錄號為MG828 958、JN871 203、JN871 199、MG828 961、MG386 033、FJ430 600、KC005 785、DQ278 919、DQ278 918、HM535 736、KX721 589、AF377 286、KM979 722、KC345 693、JN542 546、KY464 140、AY620 998、HQ339 998、KT268 764、EF413 595、GU973 504、KY814 539、HQ874 466、EU707 430、DQ323 542、EU167 609、DQ323 528、KU143 712、EU622 267、KR476 746、MF190 121、JN943 495、AY739 018、JN943 491、KT001 450，所有基因序列均從Gen Bank下載。用DNAMAN軟件對刺盤孢屬及刺盤孢屬近似屬的ITS序列進(jìn)行同源性比對，根據(jù)序列比對結(jié)果，選取序列屬間有差異位點的區(qū)域，利用Primer5 軟件設(shè)計刺盤孢屬特異性引物并合成。

用設(shè)計的引物對刺盤孢屬菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25L，包括10×TaqBuffer 2.5L，2.5 mmol/L dNTP 2L，2.5 U/LTaqDNA酶0.2L，上下游引物(10mol/L)各0.5L，模板DNA 1L，ddH2O 18.3L。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5L PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳30 min(1×TAE電泳緩沖液，GeneGreen核酸染料染色，110V 電壓)，在凝膠成像系統(tǒng)上檢測并拍照。

1.2.3 引物特異性驗證

用設(shè)計的引物對序號為46～51號的刺盤孢屬近似屬真菌菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件及檢測拍照同1.3，由檢測結(jié)果分析設(shè)計的引物擴(kuò)增刺盤孢屬的特異性。

1.2.4 引物靈敏度檢測

用核酸檢測儀測定菌株的基因組DNA濃度，以序號15號的Colletotrichumdestructivum菌株的DNA為模板，用滅菌的超純水將其DNA(起始DNA濃度為2.2 ng/L)按10倍梯度稀釋到100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7g /L，以不同濃度的DNA分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，其反應(yīng)體系和程序同1.4。反應(yīng)結(jié)束后取5L PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳30 min(1×TAE電泳緩沖液，GeneGreen核酸染料染色，110V 電壓)，在凝膠成像系統(tǒng)上檢測并拍照。

1.2.5 樣品檢測

對采集的帶炭疽病梨果實、健康梨果實、人工接種刺盤孢屬病原菌的梨果實樣品進(jìn)行檢測。其中對帶炭疽病梨果實樣品分別取發(fā)病處的植物組織與發(fā)病周邊的植物組織，人工接種刺盤孢屬病原菌的梨果實取有病變癥狀處的植物組織，健康樣品取健康組織，研磨后用天根新型植物基因組DNA提取試劑盒(DP305-03)提取DNA，用設(shè)計的引物按照1.3的擴(kuò)增體系及程序?qū)μ崛〉腄NA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性引物設(shè)計及PCR擴(kuò)增

利用DNAMAN軟件對刺盤孢屬及刺盤孢屬近似屬真菌的ITS基因序列進(jìn)行比對，找到刺盤孢屬內(nèi)保守的區(qū)域，屬間有明顯差異的區(qū)域，用軟件Primer5對刺盤孢屬特異性區(qū)域設(shè)計得到擴(kuò)增其ITS基因的特異性引物：ITS-c3：5'-GAGTTWMCGCTCTAYAACCCT-3'，ITS-c4：5'-CTCCGGATCCCAGTGCGAGA-3'，產(chǎn)物大小449 bp。

用設(shè)計的引物ITS-c3/c4對序號1～45號的刺盤孢屬菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1A,B)，特異性引物ITS-c3/c4從40株不同種的刺盤孢屬菌株DNA中擴(kuò)增得了到449 bp的條帶，條帶明亮單一，說明引物ITS-c3/c4能夠擴(kuò)增不同種的刺盤孢屬真菌ITS基因序列。圖1

A、B：刺盤孢屬PCR擴(kuò)增電泳。A圖中，M：DL2000 Marker；1～24：菌株1～27號。B圖中，M：DL2000 Marker；1～16：菌株28～45號。17：陰性對照。菌株序號見表1

A、B：PCR amplified electrophoresis ofColletotrichum. In Fig A, M:DL2000 Marker; 1-24: Strain 1-27. In Fig B,M: DL2000 Marker; 1-16: Strain 28-45. 17:Negative control. The Sequenceno of strains is shown in
Table 1

圖1 刺盤孢屬真菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜
Fig. 1 PCR amplified products electrophoresis ofcolletotrichum

2.2 引物特異性驗證

用設(shè)計的引物ITS-c3/c4對序號為46～51號的刺盤孢屬近似屬真菌菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取1、23、33號刺盤孢屬菌株做陽性對照，以滅菌超純水做陰性對照。從圖中可看出第1～6電泳帶的刺盤孢屬近似屬未有擴(kuò)增條帶，而第7～9電泳帶上的刺盤孢屬菌株擴(kuò)增到449 bp的條帶，第10條電泳帶的陰性對照也未有擴(kuò)增出條帶，說明設(shè)計的引物對檢測刺盤孢屬真菌具有特異性。圖2

M：DL2000 Marker；1～6：菌株46～51；7：菌株1；8：菌株23，9：菌株33；10：陰性對照。菌株序號見表1

M:DL2000 Marker; 1-6: Strain 46-51; 7: Strain 1; 8: Strain 23; 9: Strain 33 ; 10:Negative control .The Sequenceno of strains is shown in
Table 1

圖2 引物特異性驗證
Fig. 2 Primer Specificity Verification

2.3 引物靈敏度檢測

以不同濃度的Colletotrichumdestructivum菌株的DNA為模板進(jìn)行PCR檢測，到第4個濃度(2.2 pg/L)梯度時，擴(kuò)增到的條帶依然較亮，到第5個濃度(0.22 pg/L)梯度時，擴(kuò)增到的條帶則明顯變暗，但依然有條帶，說明該對引物具有較高的靈敏度。圖3

2.4 樣品檢測

用設(shè)計的引物對采集的帶炭疽病梨果實的發(fā)病處與發(fā)病周邊組織、健康的梨果實、人工接種刺盤孢屬病原菌的梨果實樣品進(jìn)行檢測，以刺盤孢屬Colletotrichumgloeosporioides菌株為陽性對照，滅菌的超純水為陰性對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增。圖中陰性對照未擴(kuò)增出條帶，陽性對照擴(kuò)增出條帶，說明擴(kuò)增體系正常。其中第1至4電泳帶的帶炭疽病梨果實樣品都擴(kuò)增出與陽性對照片段大小一致的條帶，第7、8電泳帶的人工接種刺盤孢屬病原菌的梨果實樣品也擴(kuò)增到了條帶，而健康的梨果實樣品中未擴(kuò)增到條帶，說明引物ITS-c3/c4能夠特異性檢測出炭疽病發(fā)病組織中的刺盤孢屬病原菌。圖4

M：DL2000 Marker；1～9：Colletotrichumdestructivum菌株的DNA濃度稀釋到100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7后PCR擴(kuò)增電泳

M:DL2000 Marker; 1-9: PCR amplified electrophoresis of DNA concentrations withColletotrichumdestructivumto 00、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7

圖3 刺盤孢屬PCR靈敏度檢測
Fig. 3 PCR sensitivity detection ofColletotrichum

M：DL2000 Marker；1～2：帶炭疽病梨果實發(fā)病處組織；3～4：帶炭疽病梨果實發(fā)病周邊處組織；5～6：健康的梨果實；7～8：人工接種刺盤孢屬病原菌的梨果實；9：陰性對照；10：陽性對照

M：DL2000 Marker; 1-2: Tissue of the diseased pear fruit with anthracnose; 3-4:Peripheral Tissue of Pear Fruit with Anthracnose; 5-6: Healthy pear fruit; 7-8:Artificial inoculation of pear fruits; 9: Negative control; 10; Positive control

圖4 用設(shè)計的引物對樣品檢測
Fig. 4 Sample Detection with Designed Primers

3 討 論

實驗用設(shè)計的引物對40株不同種的刺盤孢屬菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，均能得到一條明亮的、目的片段大小的條帶，說明該對引物對刺盤孢屬屬內(nèi)的種都能檢測到。在設(shè)計引物找尋ITS基因序列刺盤孢屬及其近似屬屬間有差異的片段時，由于在NCBI上并非所有的近似屬都有ITS基因序列提交，因此,在對屬間ITS基因序列比對時，只選取了有序列提交的近似屬ITS基因序列作為比對，并選取差異區(qū)域設(shè)計引物；在驗證刺盤孢屬引物特異性時，由于近似屬菌株資源受限，只對5個近似屬的6株菌株進(jìn)行了驗證，驗證結(jié)果為該引物具有較強(qiáng)的特異性，只能擴(kuò)增刺盤孢屬，其它近似屬未能擴(kuò)增到條帶。用設(shè)計的引物對炭疽病發(fā)病樣品及人工接種刺盤孢屬病原菌樣品進(jìn)行檢測，均可從發(fā)病組織中檢測出刺盤孢屬真菌。

實驗在設(shè)計刺盤孢屬特異性引物時，選取的是屬內(nèi)保守區(qū)域，因此,ITS-c3/c4該對引物只能檢測到屬，對屬以下的種不能鑒定；通過對刺盤孢屬內(nèi)菌株的ITS基因序列比對發(fā)現(xiàn)，靠ITS一個基因是很難完全對種間進(jìn)行檢測鑒定的，需要考慮多個基因同時檢測。研究能通過PCR方法快速的將病原菌鑒定到屬，為今后該屬真菌的分類鑒定研究奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

對刺盤孢屬及其近似屬的ITS基因序列進(jìn)行比對，針對刺盤孢屬特異性位點設(shè)計出常規(guī)PCR檢測刺盤孢屬的特異性引物ITS-c3/c4，引物序列為：ITS-c3：5'-GAGTTWMCGCTCTAYAACCCT-3'，ITS-c4：5'-CTCCGGATCCCAGTGCGAGA-3'；用該對引物對40株不同種刺盤孢屬菌株P(guān)CR擴(kuò)增，均擴(kuò)增得到449 bp條帶；通過對該對引物特異性驗證，6株刺盤孢屬近似屬菌株均未擴(kuò)增到條帶；對該引物靈敏度進(jìn)行檢測，其靈敏度達(dá)2.2 pg/L；用建立的體系對炭疽病發(fā)病樣品及人工接種樣品檢測，均可從發(fā)病組織中檢測出刺盤孢屬病原菌；建立了刺盤孢屬真菌PCR檢測體系。建立的PCR方法可靠，可將刺盤孢屬與近似屬區(qū)分開，能夠快速、準(zhǔn)確檢測出刺盤孢屬真菌。