鐵氰化鉀法測定藥用麥芽糊精中還原糖含量

陳 皓 ，周 冰 ，黃桂琴

（1.重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院有限責(zé)任公司，重慶 400065； 2.重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 401331）

在食品行業(yè)中，麥芽糊精可用作糖果、果汁、糕點(diǎn)中的功能性原料和調(diào)節(jié)劑[1]。其溶液能在胃腸道快速釋放葡萄糖的同時(shí)又不含果糖、半乳糖、乳糖和蔗糖等，特別適用于那些消化道糖不耐受疾病患者[2]。在制藥工業(yè)中，麥芽糊精可用作藥物輔料，如口服固體制劑的填充劑、液體制劑增稠劑和藥物助分散劑等，可將其作為片劑的直壓型輔料[3]、口腔膜劑的填充劑[4]和擠壓成型速釋片的基質(zhì)材料[5]等，近年來也廣泛應(yīng)用于納米藥物包封、3D打印藥物[6]等一些新興制藥領(lǐng)域。從馬鈴薯、玉米、大米等農(nóng)作物中提取出淀粉，經(jīng)適當(dāng)工藝水解可制得麥芽糊精，其主要成分是系列鏈長分布范圍較寬的糖類化合物，包括多聚糖、低聚糖、寡糖等[7]。還原糖含量也稱為葡萄糖當(dāng)量（DE），可作為劃分不同規(guī)格產(chǎn)品的依據(jù)?！睹绹幍洹罚║nited States Pharmacopoeia）收載有麥芽糊精標(biāo)準(zhǔn)[8]，采用斐林試劑法檢測還原糖含量。該方法操作和計(jì)算不復(fù)雜，但影響試驗(yàn)結(jié)果的因素較多，如還原糖實(shí)際含量、溶液濃度、加熱效率、共沸時(shí)間、滴定速度、終點(diǎn)觀察等[9]。本研究中建立了利用鐵氰化鉀等試劑與麥芽糊精中的還原糖反應(yīng)后，用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，為藥用麥芽糊精的還原糖含量檢測提供了新思路。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

XS105Du型電子天平（梅特勒-托利多國際貿(mào)易＜上海＞有限公司）；Agilent Cary 8454型紫外可見分光光度計(jì)（安捷倫科技有限公司）；HH-S26S型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市大地自動(dòng)化儀器廠）。

1.2 試藥

鐵氰化鉀（成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號為2017110801）；六水合三氯化鐵（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號為20180110）；無水草酸（成都化夏化學(xué)試劑有限公司，批號為2017011702）；碳酸鈉（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，批號為20160218）；D-無水葡萄糖（美國Sigma-Aldrich公司，批號為SLBP5997V）；五水硫酸銅（廣東光華科技股份有限公司，批號為20171024）；酒石酸鉀鈉（成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號為2018040201）；氫氧化鈉（重慶川東化工集團(tuán)有限公司，批號為20180301）；次甲基藍(lán)（三水，上海三愛思試劑有限公司，批號為20180202）；藥用麥芽糊精（山東西王集團(tuán)有限公司，批號為1805013）。

2 方法與結(jié)果

2.1 美國藥典方法

根據(jù)《美國藥典》（USP41）方法，取葡萄糖制備成質(zhì)量濃度為10 g／L的對照品溶液。取麥芽糊精5 g，制得質(zhì)量濃度為50 g／L的供試品溶液。

取堿性酒石酸銅試液25 mL，置錐形瓶中，平行取2份。其中1份在2 min內(nèi)加熱至沸騰，并用對照品溶液滴定到近終點(diǎn)（比預(yù)期終點(diǎn)少0.5 mL），保持微沸，加亞甲藍(lán)溶液（1%，g／mL）2滴，在1 min內(nèi)用對照品溶液完成滴定（藍(lán)色消失）；再將另1份加熱至沸，用供試品溶液作滴定液，同法滴定，計(jì)算得還原糖含量為5.80%（以葡萄糖計(jì)）。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，多個(gè)方法參數(shù)，如加熱溫度、沸騰狀態(tài)、指示劑加入時(shí)機(jī)等均不易精確控制，且還直接影響試驗(yàn)結(jié)果。

擇期，更換試驗(yàn)員，同法測定同一批供試品，計(jì)算得還原糖含量為6.62%（以葡萄糖計(jì)）。2次結(jié)果相對極差為13.2%。斐林試劑法可能存在結(jié)果不易重現(xiàn)的問題。

在制藥行業(yè)中，分析方法在其整個(gè)生命周期里往往面臨在多個(gè)實(shí)驗(yàn)室間轉(zhuǎn)移的需求，因此需要方法的影響因素易控，結(jié)果易重現(xiàn)。當(dāng)需要測定藥用麥芽糊精時(shí)，斐林試劑法不作首選。

2.2 鐵氰化鉀法

2.2.1 原理

鐵氰化鉀法又稱為Park-Johnsonferricyanide submicromethod[10]。鐵氰化鉀是一種具有氧化性的絡(luò)合物，在一定條件下，麥芽糊精中還原糖與鐵氰化鉀發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成無色的亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀可繼續(xù)與三氯化鐵發(fā)生顯色反應(yīng)，定量生成普魯士藍(lán)，此化合物在草酸溶液中具有一定的穩(wěn)定性[11]，有明顯的可見光吸收?；瘜W(xué)反應(yīng)式步驟如下。

2.2.2 溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：精密量取葡萄糖貯備液（質(zhì)量濃度為 1 g ／L）0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL，分別置 100 mL 容量瓶中，加水定容。精密量取各5 mL，分別置5支試管中，均加入碳酸鈉溶液2 mL和鐵氰化鉀試液2 mL，置70℃水浴中加熱30min，取出，迅速用流水冷卻至室溫，用草酸溶液將pH調(diào)至3.6，加入三氯化鐵溶液5 mL，靜置5 min使顯藍(lán)色，再分別移至50 mL容量瓶中，用水定容。

供試品溶液：稱取樣品粉末60 mg，置100 mL容量瓶中，加水定容，精密量取2.0 mL，置試管中，精密加水3 mL、碳酸鈉溶液2 mL和鐵氰化鉀試液2 mL，置70℃水浴中加熱30min，取出，迅速用流水冷卻至室溫，用草酸溶液將pH調(diào)至3.6，加入三氯化鐵溶液5 mL，靜置5 min使顯藍(lán)色，再分別移至50 mL容量瓶中，加水定容。

2.2.3 測定波長選擇

取葡萄糖貯備液，用水稀釋成20 μg／mL，精密量取5 mL，置試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液項(xiàng)下方法顯色后，在600～800 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果在700～720nm波長范圍內(nèi)吸收波段較強(qiáng)，最終選擇710 nm作為測定波長。

圖1 紫外吸收光譜圖

2.2.4 鐵氰化鉀用量選擇

取葡萄糖貯備液，用水稀釋成2 μg／mL，精密量取5 mL，置試管中，平行5份，各加碳酸鈉溶液2 mL、鐵氰化鉀試液0.5～2.5 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液項(xiàng)下方法顯色后，在 710 nm 波長處顯色。鐵氰化鉀用量為 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL 時(shí)，吸光度分別為 0.592 4，0.632 5，0.635 0，0.643 4，0.641 5。結(jié)果表明，鐵氰化鉀試液的加入量在1.0～2.5 mL范圍內(nèi)，吸光度穩(wěn)定。

2.2.5 溫度、時(shí)間考察

鐵氰化鉀與還原糖的反應(yīng)需要堿性環(huán)境和較高的溫度條件，加熱時(shí)間對結(jié)果也有明顯影響。經(jīng)多次試驗(yàn)，當(dāng)水浴溫度為65～100℃、水浴時(shí)間不低于25 min時(shí)，測定結(jié)果穩(wěn)定。

2.3 樣品含量測定

取麥芽糊精樣品，按鐵氰化鉀法供試品溶液項(xiàng)下方法顯色后，于710 nm波長處測定吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算其中的還原糖含量。平行測定6份，還原糖以葡萄糖計(jì)。詳見表1。

表1 樣品含量測定結(jié)果（n＝6）

2.4 鐵氰化鉀法驗(yàn)證

重復(fù)性試驗(yàn)：由不同試驗(yàn)人員，在不同日期，按鐵氰化鉀法分別測定還原糖含量，結(jié)果分別為6.13%和6.04%，考察2 d結(jié)果的相對極差為1.50%。

線性關(guān)系考察：以顯色反應(yīng)的相應(yīng)試劑為空白溶液。取已顯色的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，于710nm波長處測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度（C，μg／mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A＝0.286C＋0.032 3，r＝0.999 7（n＝5）。結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在 0.50 ～ 4.00 μg／mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

定量限確定：取空白溶液，于710 nm波長處測定20次吸光度，并統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（σ），再結(jié)合回歸方程的斜率（S）計(jì)算。定量限 ＝（10× σ）／S＝（10×0.003 7）／0.286 ＝ 0.13 μg ／mL。

準(zhǔn)確度試驗(yàn)：取已知還原糖含量（以葡萄糖計(jì)）為6.1%的麥芽糊精樣品約60 mg，用水溶解后取溶液適量（相當(dāng)于麥芽糊精 1.2 mg，還原糖 73.2 μg），平行 9份，按已知還原糖含量的80%，100%，120%加入葡萄糖對照品，每個(gè)比例3份，稀釋至線性范圍內(nèi)，依法測定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

3 討論

還原糖含量是麥芽糊精等多糖類化合物的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)。前人總結(jié)了常見的還原糖測定方法，大致可分為堿性酒石酸銅（斐林試劑）法、堿性銅溶液法、堿性汞溶液法、堿性鐵氰化物法、低碘酸鹽法、亞硒酸法等[12]。美國藥典采用斐林試劑法測定麥芽糊精還原糖，但存在一些不足，有改進(jìn)必要。

本研究中建立了一種基于堿性鐵氰化物還原的分光光度法測定麥芽糊精的還原糖含量，其線性范圍為0.50～4.00μg／mL，相關(guān)系數(shù)大于0.999，RSD小于5%，回收率為89.69% ～100.21% 。不同人員的測定結(jié)果較斐林試劑法易于重現(xiàn)。本方法中，在0.18～1.18 AU范圍內(nèi)，還原糖濃度與有色產(chǎn)物吸光度線性關(guān)系良好。但麥芽糊精有多種規(guī)格，其還原糖含量分布范圍較寬，還原糖含量為5%～20%。為了避免高含量規(guī)格糊精制備的供試品溶液濃度超出線性范圍，可參考美國藥典的方法，先進(jìn)行1次預(yù)試驗(yàn)，估算待測糊精的還原糖大致濃度范圍，再設(shè)計(jì)合理的稀釋倍數(shù)，使溶液終濃度落在本方法的線性范圍內(nèi)，以便獲得滿意的測定結(jié)果。

文獻(xiàn)[13]報(bào)道，普魯士藍(lán)由亞鐵氰化鉀和氯化鐵反應(yīng)制得，不同比例的反應(yīng)物所得的產(chǎn)品不同。當(dāng)反應(yīng)物之比為1∶1時(shí)，產(chǎn)物是亞鐵氰化鐵鉀，為可溶性普魯士藍(lán)；當(dāng)反應(yīng)物之比為3∶4時(shí)，產(chǎn)物是亞鐵氰化鐵，為不溶性普魯士藍(lán)。氯化鐵用量遠(yuǎn)大于第1步反應(yīng)中產(chǎn)生的亞鐵氰化鉀的量，推測終產(chǎn)物中有亞鐵氰化鐵出現(xiàn)。為此，加入草酸提高了不溶性普魯士藍(lán)的可溶性。

新建的鐵氰化鉀法測定麥芽糊精還原糖的靈敏度好，操作簡便，參數(shù)易控，結(jié)果穩(wěn)定。在麥芽糊精及其他多糖化合物的還原糖含量測定中具有廣闊的應(yīng)用前景。