地黃炮制蛇床子工藝條件研究

王 平，田茂軍，劉 源

(六盤水師范學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，貴州 六盤水 553004)

1 引言

蛇床子，別名野胡蘿卜子，為傘形科植物蛇床Cnidium monnieri(L.) Cuss.的干燥成熟果實(shí)，主要含揮發(fā)油、蛇床子素(Osthole)、異虎耳草素(Isopimpinellin)和花椒毒酚(Xanthotoxol)等化學(xué)成分[1,3]，其中蛇床子素(Osthole)是其主要活性成分，含量較高，約占總香豆素的60%[2]。蛇床子具有溫腎壯陽(yáng)、散寒祛風(fēng)、燥濕殺蟲之功效，臨床上以外用為主，多用于治療外科、婦科、皮膚諸疾[4-5]。蛇床子在《本經(jīng)》中列為上品，蛇床子生用氣味惡劣，損脾敗胃令人作吐，若內(nèi)服入煎及丸散等必須炮制后用。蛇床子的炮制在南北朝劉宋時(shí)代的《雷公炮炙論》中用濃藍(lán)汁百部根自然汁浸后曬干再用生地黃汁拌蒸，唐代《理傷》中則用炒法，《本草述鉤元》中用酒生地汁拌蒸。石繼連等[6]對(duì)蛇床子炮制進(jìn)行了研究，結(jié)果表明蛇床子素的含量隨蛇床子的加熱程度增加而減少，并且測(cè)定了蛇床子不同炮制品中總香豆素含量。沈迪等[7]對(duì)不同炮制工藝對(duì)蛇床子理化性質(zhì)和蛇床子素含量的影響就行了研究，表明蛇床子炮制之后，蛇床子的主要活性成分蛇床子素的含量降低。田茂軍等[8]對(duì)酒制蛇床子炮制工藝的正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選進(jìn)行了研究，結(jié)果為最佳炮制工藝條件為加20 mL黃酒，悶潤(rùn)4 h，蒸2 h，此工藝穩(wěn)定可行。田茂軍等人[9]還對(duì)蛇床子不同炮制品中的總黃酮含量測(cè)定進(jìn)行了研究，結(jié)果表明紫外分光光度法測(cè)定蛇床子不同炮制品中的總黃酮含量操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好,實(shí)驗(yàn)方法切實(shí)可行。目前采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定地黃汁炮制蛇床子中總香豆素含量的研究，以及地黃汁制蛇床子的工藝鮮有報(bào)道。鑒于此，本文用地黃炮制蛇床子，在地黃汁的體積、蒸時(shí)間、悶潤(rùn)時(shí)間、浸蒸次數(shù)單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交進(jìn)一步進(jìn)行工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用紫外分光光度計(jì)法測(cè)量其中總香豆素含量，以總香豆素含量為指標(biāo)，獲得地黃炮制蛇床子的最佳工藝，為地黃炮制蛇床子及內(nèi)服提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、材料與試劑

AL204型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；101B-1型恒溫干燥箱(浙江蕭山黨山防爆電器廠)；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；萬(wàn)用電爐0-1000W(北京市泰和格潤(rùn)有限公司)。

生地黃(購(gòu)買于河南省焦作市溫縣)，蛇床子為干品(購(gòu)買于六盤水市老百姓大藥房，產(chǎn)地河北)，香豆素對(duì)照品(上海如吉生物技術(shù)有限公司，純度≥98%)；95%乙醇(分析純)。

2.2 實(shí)驗(yàn)原材料的制備

鮮地黃沖洗干凈，放入石研缽用研棒舂碎，為了避免和鐵類物質(zhì)接觸，研棒采用木棒；生地黃舂碎后，紗布絞汁備用。

2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

圖1 香豆素對(duì)照品光譜掃描圖
Fig.1 spectroscopic scanning of coumarin reference substance

圖2 地黃制蛇床子樣品總香豆素的光譜掃描圖Fig.2 spectroscopic scanning of total coumarin in Rehmannia glutinosa

分別掃描香豆素對(duì)照品溶液和樣品溶液在250～400 nm范圍內(nèi)的波譜，如圖1、圖2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照品溶液和樣品溶液在323 nm處都有一個(gè)吸收峰，能很好的進(jìn)行定量測(cè)定，因此將323 nm作為測(cè)定地黃炮制蛇床子中總香豆素的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 地黃汁體積

圖3 地黃汁體積對(duì)總香豆素含量影響
Fig.3 Effect of rehmannia glutinosa juice volume on total coumarin content

稱取一定量的蛇床子生品，體積約30 mL，固定蒸時(shí)間2 h，悶潤(rùn)時(shí)間2 h，浸蒸次數(shù)為一次，考察地黃汁體積5 ，10 ， 15l， 20 ，25 mL 對(duì)地黃制蛇床子炮制工藝的影響，總香豆素含量分別1.907%，1.702%，1.320%，1.257%，1.089%，炮制品的顏色隨著地黃汁體積的用量增加由綠黃色逐漸變?yōu)楹谏诟杏扇肟诼槔鞭D(zhuǎn)為入口先清涼而后才有麻的感覺。表明總香豆素的含量隨地黃汁體積增大逐漸降低，但降低幅度逐漸減小。因此選擇5 mL，15 mL，25 mL 為正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化3個(gè)水平因素。

2.4.2 蒸時(shí)間

圖4 蒸的時(shí)間對(duì)地黃汁炮制蛇床子中總香豆素的影響
Fig.4 Effect of steaming time on total coumarin in fructus cnidii prepared with rehmannia glutinosa juice

稱取一定量的蛇床子生品，體積約為30 mL，固定生地黃汁體積15 mL，悶潤(rùn)時(shí)間為2 h，浸蒸的次數(shù)為一次，蒸的時(shí)間為2 h，4 h，6 h，8 h，10 h時(shí)對(duì)地黃制蛇床子炮制工藝的影響，總香豆素含量分別為1.442%，1.536%，1.723%，1.321%，1.145%。總香豆素的百分含量與蒸的時(shí)間之間關(guān)系曲線如圖2.2.2所示。從圖中可以看出總香豆含量隨蒸時(shí)間增加含量緩慢增加后又降低因此選擇2 h， 6 h，10 h為正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化3個(gè)水平因素。

2.4.3 悶潤(rùn)時(shí)間

圖5 悶潤(rùn)時(shí)間對(duì)地黃汁炮制蛇床子中總香豆素的影響
Fig.5 Effect of Moistening Time on Total Coumarin in Fructus Cnidii Prepared with Rehmannia glutinosa Juice

稱取一定量的蛇床子生品，體積約為30 mL，固定生地黃汁15 mL，蒸時(shí)間為 2 h，浸蒸的次數(shù)為一次，悶潤(rùn)時(shí)間為2 h，4 h，6 h，8 h，10 h時(shí)對(duì)地黃制床子炮制工藝的影響，測(cè)定其總香豆素含含量分別為1.231%，1.450%，1.435%，1.394%，1.140%。表明總香豆含量隨悶潤(rùn)時(shí)間增加含量緩慢增加后又降低，因此選擇2 h，6 h，10 h為正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化3個(gè)水平因素。

2.4.4 地黃汁浸蒸的次數(shù)

圖6 蒸的時(shí)間對(duì)地黃汁炮制蛇床子中總香豆素的影響
Fig.6 Effect of Steaming Time on Total Coumarin in Fructus Cnidii Prepared with Rehmannia glutinosa Juice

稱取一定量的蛇床子生品，體積約為30 mL，加入生地黃汁15 mL，悶潤(rùn)時(shí)間為2 h，蒸的時(shí)間為2 h，浸蒸的次數(shù)分別為一次，二次，三次對(duì)地黃制蛇床子炮制工藝的影響，測(cè)定其總香豆素含量分別為17.01%，1.435%，1.290%，總香豆素含量隨浸蒸的次數(shù)增加而逐漸降低。

2.5 總香豆素含量測(cè)定

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取蛇床子素對(duì)照品0.0200 g，用80%乙醇溶解，定容到100 mL容量瓶，即得濃度為200 μg/mL的蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

移取蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.25,0.50,1.00 ,2.00 ,4.00 mL于50 mL容量瓶中用80%乙醇定容，即得溶液為1.00 μg/mL、2.00 μg/mL、4.00 μg/mL、8.00 μg/mL、16.00 μg/mL、32.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線待測(cè)定溶液。紫外分光光度法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，以80%乙醇作為空白參比，在323 nm處測(cè)定。以濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程(C=15.83778*A-0.40145 R2=0.9995)，由線性回歸方程可知蛇床子素溶液濃度在1.00-32.00 μg/mL范圍內(nèi)，蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度與濃度的線性關(guān)系良好。

2.5.3 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取樣品0.5000 g置于錐形瓶中，加入80%乙醇30 mL浸泡后，超聲提取60 min(設(shè)定功率為60%)，然后進(jìn)行過(guò)濾，濾液用80%乙醇定容到50 mL容量瓶，即得樣品溶液。

2.6 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的研究數(shù)據(jù)，進(jìn)一步優(yōu)化工藝，選取影響蛇床子炮制各因素中有意義的水平做正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析，以確定最佳的提取條件。采用L9(34)正交表，以地黃汁體積(A)、蒸時(shí)間(B)、悶潤(rùn)時(shí)間(C)、浸蒸次數(shù)(D)作為4個(gè)考察因素，選取3個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 地黃制蛇床子的炮制工藝正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Level of factors in orthogonal test for processing technology of Rehmannia glutinosa Cnidii

按表1的正交因素水平設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 地黃制蛇床子的炮制工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental design and results of processing technology of Rehmannia glutinosa Cnidii

由表2的極差分析結(jié)果可以看出，RA>RB>RD>RC，4個(gè)因素對(duì)地黃汁炮制蛇床子的影響大小依次為：地黃汁的體積(A)>蒸的時(shí)間(B)>浸蒸的次數(shù)(D)>悶潤(rùn)時(shí)間(C)。四個(gè)因素中，地黃汁的體積、蒸的時(shí)間和浸蒸的次數(shù)較為顯著，其中影響最大的是地黃汁的體積。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，優(yōu)化得到地黃汁炮制蛇床子的最佳條件為A1B2C1D1，即地黃汁的體積為5 mL，蒸的時(shí)間為6 h，悶潤(rùn)的時(shí)間為2 h，浸蒸的次數(shù)為一次。

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按A1B2C1D1(地黃汁體積10 mL，蒸時(shí)間4 h，悶潤(rùn)時(shí)間2 h，蒸次數(shù)1次)條件進(jìn)行3次平行炮制，三次蛇床子炮制品中總香豆素百分含量分別是1次：1.123%，2次：1.130%，3次：1.119%，3次平行實(shí)驗(yàn)總香豆素平均百分含量值為1.124%，符合2010版《中國(guó)藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果與討論

(1)實(shí)驗(yàn)選擇香豆素對(duì)照品作為對(duì)照，在波長(zhǎng)為250～400 nm處，應(yīng)用紫外可見分光光度法對(duì)香豆素對(duì)照品和樣品中香豆素進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)香豆素對(duì)照品和樣品在323 nm處都有一個(gè)吸收峰，能很好的進(jìn)行定量測(cè)定，因此將323 nm作為測(cè)定的波長(zhǎng)。紫外可見分光光度法測(cè)定地黃制蛇床子中香豆素操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，在測(cè)定地黃制蛇床子中香豆素含量中是切實(shí)可行的。

(2)實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選得出地黃汁炮制蛇床子的最佳工藝條件如下：地黃汁體積為5 mL，蒸時(shí)間為6 h，悶潤(rùn)時(shí)間為2 h，浸蒸的次數(shù)為一次，蛇床子炮制品中的總香豆素含量為1.124%，符合2010版《中國(guó)藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

(3)在地黃汁炮制蛇床子過(guò)程中，炮制品的顏色隨著地黃汁體積的用量增加由綠黃色逐漸變?yōu)楹谏?，口感由入口麻辣轉(zhuǎn)為入口先清涼而后才有麻的感覺。但地黃汁的體積用量增大炮制品中蛇床子中的香豆素含量降低，浸蒸的次數(shù)也影響炮制品的口感。因此若不考慮炮制品中總香豆素含量的前提下適當(dāng)增加地黃汁的體積和浸蒸的次數(shù)，以達(dá)到消除其辣味，實(shí)現(xiàn)炮制服用的目的。