鉬對桃樹葉片低溫傷害的緩解作用

郜懷峰，彭福田，肖元松，張亞飛，王國棟，孫希武，賀 月

（山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院，作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271018）

低溫作為一種非常重要的非生物脅迫因子，能夠影響農(nóng)作物的生長、產(chǎn)量和地域分布等[1]。鉬是高等植物正常生長發(fā)育和生理代謝的必需微量元素之一，研究表明，鉬可以影響小麥等植物的生理代謝過程[2-3]，提高植物抗逆性。近年來，由于氣候變化異常，極端天氣時有發(fā)生。倒春寒使桃樹在生長期遭遇0℃以下低溫而使細胞組織受傷害，是一種生理病害，會對桃樹枝梢幼葉造成很大傷害，影響葉片正常的生長發(fā)育和生理功能，造成巨大的經(jīng)濟損失，如何降低低溫傷害是影響桃樹生產(chǎn)的重要因素。目前，對桃樹低溫冷害的研究只停留在田間自然條件下的低溫對果實外形及產(chǎn)量的影響方面[4]，對其生理生化指標的研究鮮見報道。因此，加強鉬對桃樹低溫脅迫傷害的緩解效果及機制研究顯得尤為重要。

鉬能通過含鉬酶調(diào)控植物體內(nèi)的碳代謝、氮代謝、激素代謝和活性氧代謝等多種生理過程，與植物的抗非生物脅迫如低溫[5]、干旱[6]、鹽害[7]等密切相關(guān)。鉬不僅能夠通過含鉬酶調(diào)控ABA和IAA的合成，還能調(diào)節(jié)鉬酶活性[8]、抗氧化酶活性[9]及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量[10]從而影響植物的抗性。它還對維持葉綠素結(jié)構(gòu)必不可少，缺鉬會使植物葉綠素含量明顯減少，結(jié)構(gòu)異常，導致葉片發(fā)黃，光合速率降低。鉬單獨存在于生物體時并不能發(fā)揮作用，只有形成鉬輔因子 (molybdenum cofactor，Moco) 結(jié)合到鉬酶上才具有生物活性[11-13]。在擬南芥中LOS5/ABA3是編碼鉬輔因子硫化酶的基因，該酶催化Moco硫酸化形式的產(chǎn)生，它是植物中ABA生物合成途徑最后一步起關(guān)鍵作用的醛氧化酶 (AO) 所必需的輔助因子[14]。由于AO家族具有廣泛的底物特異性，推測AO不僅調(diào)控激素合成，還參與除植物激素合成外的其他代謝活動，研究表明，植物體內(nèi)AO不僅可以催化H2O2產(chǎn)生，還能催化的產(chǎn)生，從而影響植物活性氧代謝[15]。

前人研究表明，缺鉬條件下施鉬能提高小麥[8]、早熟禾[16]、草坪[17]等植物的抗凍性。低溫脅迫下，施鉬提高了小麥和草坪草海濱雀稗超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶 (POD)、過氧化氫酶 (CAT) 活性，增加了小麥抗壞血酸 (ASA)、還原型谷胱甘肽(GSH)、類胡蘿卜素 (CAR) 含量，降低了活性氧自由基的含量[8,17-18]，提高了植物清除活性氧的能力，減小了活性氧對細胞的傷害。施鉬能夠增加冬小麥可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、脯氨酸含量，且脯氨酸比可溶性蛋白和可溶性糖能更早、更敏感、更顯著地響應(yīng)低溫脅迫[3]。但鉬能否提高桃樹抗凍性、緩解低溫脅迫造成的傷害，至今未見報道。為此，本試驗以毛桃實生苗為試材，研究低溫脅迫下，鉬酸銨對桃葉片細胞膜氧化傷害、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及抗凍相關(guān)基因鉬輔因子硫化酶、脯氨酸合成酶及過氧化物酶表達的影響，明確鉬對桃樹低溫脅迫傷害的緩解效果及機制，以期為生產(chǎn)中緩解桃樹低溫脅迫傷害提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

試驗以當年生毛桃 (Amygdalus persicaL.) 實生苗為試材，于2017年在山東農(nóng)業(yè)大學南校區(qū)試驗站進行。

選取長勢一致、無病蟲害的20片葉毛桃實生苗定植于盆中，每盆定植1株，盆為圓柱形，內(nèi)徑10 cm、高8 cm，盆內(nèi)栽培基質(zhì)為營養(yǎng)土和蛭石，按1∶1比例混合，基質(zhì)基本理化性狀為pH 6.81、有機質(zhì)37.64 g/kg、速效氮162.34 mg/kg、速效磷123.73 mg/kg、速效鉀140.36 mg/kg，土壤鉬含量為0.43 mg/kg (低于土壤平均水平1.7 mg/kg)，有效鉬含量為0.104 mg/kg (處于臨界水平，低于0.1 mg/kg為缺鉬水平)，每盆基質(zhì)重量為1.5 kg。試驗設(shè)5個處理為：清水 (M0)；0.01%鉬酸銨 (M1)；0.04%鉬酸銨(M2)；0.08%鉬酸銨 (M3)；0.12%鉬酸銨 (M4)。每個處理設(shè)9個重復。每隔5天噴施一次，每次噴50 mL，一共噴3次。第3次后，將實生苗置于冷光源植物生長箱 (0℃，5000 lx，12 h光照) 中進行低溫脅迫處理，于0 h、12 h、24 h、48 h測定其電導率，48 h后測定葉片鉬含量、凍害指數(shù)、相對電導率、SPAD值、凈光合速率、脯氨酸、可溶性糖等，選取最佳噴施鉬酸銨濃度。

為進一步研究鉬酸銨對桃實生苗低溫脅迫的緩解作用及其機制，根據(jù)上一試驗分析結(jié)果，研究0.04%鉬酸銨對桃低溫脅迫下，葉片可溶性糖、脯氨酸及抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響。選取另一批長勢一致、無病蟲害的20片葉毛桃實生苗進行試驗，試驗設(shè)計為：清水 + 常溫 (CK)；清水 + 0℃ (T1)；0.04%鉬酸銨 + 常溫 (T2)；0.04%鉬酸銨 + 0℃(T3)。各處理選9株長勢基本一致的實生苗，每隔5天噴施一次，每次50 mL，一共噴施3次。第3次處理后，將T1、T3置于冷光源植物生長箱 (0℃，5000 lx，12 h光照) 中，CK、T2置于冷光源植物生長箱 (20℃，5000 lx，12 h光照)，分別于0 h、24 h、48 h取相同葉位功能葉片測定可溶性糖、脯氨酸、抗氧化酶活性和丙二醛含量，部分樣品液氮速凍，-80℃保存，測定LOS5/ABA3、P5CS1及RCI3表達量。

1.2 指標測定

1.2.1 桃實生苗葉片鉬含量測定 參照Wang等[19]方法進行，稱取桃實生苗葉片干樣0.3 g于消解管中，加入5 mL優(yōu)級純濃硝酸浸泡過夜后，再加入2 mL優(yōu)級純雙氧水，采用微波消解萃取儀進行消解，消解完全冷卻后轉(zhuǎn)移至比色管中，用超純水定容至50 mL，放置過夜即可得樣品待測液。采用相同消解方法制備空白對照組，用Nex ION 300X型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定鉬含量。每處理3個重復，結(jié)果取其平均值 (下同)。

1.2.2 凍害指數(shù) 低溫脅迫后，統(tǒng)計葉片的傷害情況。只要葉片上出現(xiàn)萎蔫、水漬狀、失綠等癥狀，均認為發(fā)生凍害。統(tǒng)計該植株發(fā)生凍害的葉片數(shù)以及植株總?cè)~片數(shù)。

凍害指數(shù) (%) = 植株上表現(xiàn)出凍害癥狀的葉片數(shù)/植株葉片總數(shù) × 100。

1.2.3 電導率 相對電導率按照李合生[20]的方法進行。鮮樣先用自來水沖洗，再用蒸餾水沖洗2次，避開主脈將葉片切割成大小一致的葉塊，混合均勻，取0.5 g，裝入大試管中，加入20 mL蒸餾水，抽氣3次，每次20 min，第一次抽氣后取出搖動，室溫保持3～4 h，多次搖動，測電導率S1，封口沸水浴10 min，冷卻，平衡10 min后測電導率S2，同時測定蒸餾水電導率S0。

相對電導率 (%) = 100 × (S1 - S0)/(S2 - S0)。

1.2.4 葉綠素SPAD值、凈光合速率 在冷光源植物生長箱內(nèi)利用CIRAS-3便攜式光合儀測定系統(tǒng)(PPSystems，英國) 測定充分展開的功能葉片凈光合速率，重復6次，取其平均值。SPAD值用SPAD-502型儀器測定，重復6次，取其平均值。

1.2.5 脯氨酸 脯氨酸含量測定采用茚三酮比色法[21]。稱取鮮樣0.5 g，加入5 mL磺基水楊酸，封口沸水浴10 min，冷卻，用濾紙漏斗過濾，吸濾液2 mL(對照吸蒸餾水2 mL)，加入2 mL冰乙酸，再加入3 mL酸性水合茚三酮顯色液，沸水浴40 min，冷卻，加入5 mL甲苯，充分震蕩，靜置分層，取上層甲苯液于520 nm下比色。計算公式：脯氨酸 (μg/g，F(xiàn)W或DW) = Y × V/a × W (Y由標準曲線查得，V為提取液體積，a為測定時吸取的體積，W為樣品重)。

1.2.6 可溶性糖 可溶性糖采用蒽酮比色法測定。葉片擦凈，剪碎，稱取0.3 g，放入刻度試管，加10 mL蒸餾水，封口，于沸水中提取30 min (提取兩次)，提取液過濾入25 mL容量瓶中，反復沖洗試管及殘渣，定容至刻度。吸取0.5 mL樣品液于20 mL試管中，加入蒸餾水1.5 mL，然后按順序向試管中加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯試劑和5 mL濃硫酸，充分震蕩，立即將試管放入沸水中，逐管準確保溫1 min，取出自然冷卻至室溫，以空白做參比，在630 nm下比色。

1.2.7 過氧化氫酶 (CAT)、丙二醛 (MDA)、過氧化物酶 (POD)、超氧化物歧化酶 (SOD) 活性測定方法

CAT活性測定采用紫外吸收法；MDA含量測定采用硫代巴比妥酸 (TBA) 比色法；POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚顯色法；SOD活性測定采用氮藍四唑光化還原法。

1.2.8 實時熒光定量PCR分析 采用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒 (北京愛德萊生物科技有限公司) 提取樣品RNA，用于實時熒光定量PCR的cDNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Perfect Real Time，TaKaRa) 獲得。實時熒光定量PCR采用SYBR Green PCR Premix Ex Taq (寶生物公司)，操作參照說明書進行，引物參見表1。用CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad，USA) 進行實時熒光定量PCR。反應(yīng)程序為：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，58℃退火30 s，40次循環(huán)。所有實時熒光定量PCR反應(yīng)均設(shè)置3次生物學重復和3次技術(shù)重復，所得數(shù)據(jù)采用進行計算。

表1 研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007進行圖表繪制，用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析及最小顯著差異性檢驗 (Duncan’s新復極差法，P〈 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下不同濃度鉬酸銨處理的桃實生苗生長狀況

對不同濃度鉬酸銨處理的桃實生苗在冷光源植物生長箱 (0℃，5000 lx，12 h光照) 中培養(yǎng)48 h后，對各組的生長狀況進行觀察分析。各處理的桃實生苗葉片發(fā)生不同程度的萎蔫和卷曲，其中，M0處理最為嚴重，葉片卷曲、萎蔫程度最重，0.04%鉬酸銨處理葉片萎蔫數(shù)量最少，但葉片也有卷曲現(xiàn)象。由此可知，鉬酸銨處理可以減輕低溫脅迫下桃實生苗葉片的萎蔫程度，以0.04%鉬酸銨處理效果最佳 (圖 1)。

2.2 不同濃度鉬酸銨對低溫脅迫下桃實生苗葉片凍害指數(shù)的影響

低溫脅迫下，桃實生苗葉片會受到不同程度的損傷，出現(xiàn)萎蔫、水漬狀、失綠等癥狀，對葉片的生理功能造成一定影響 (圖1)。在低溫脅迫后，對5個處理的葉片凍害指數(shù)進行統(tǒng)計分析。由表2可知，相對于M0 (清水) 處理，鉬酸銨處理能顯著降低葉片受凍指數(shù)，減輕葉片萎蔫程度，M1、M2、M3、M4處理凍害指數(shù)分別降低了23.8%、38.4%、29.6%、24.0%，以0.04%鉬酸銨 (M2) 處理效果最佳，與其他處理差異顯著 (P〈 0.05)。

2.3 不同濃度鉬酸銨對桃實生苗葉片鉬含量的影響

對不同濃度鉬酸銨處理的桃實生苗葉片鉬含量進行測定。與對照相比，噴施鉬酸銨顯著提高了葉片鉬含量，濃度為0.01%、0.04%、0.08%、0.12%的鉬酸銨處理分別是M0處理的2.04倍、3.33倍、4.25倍和4.45倍，差異顯著。可見，桃實生苗葉片鉬含量隨著噴施鉬酸銨濃度的增加而升高 (圖2)

圖1 低溫脅迫下不同濃度鉬酸銨處理的桃實生苗生長狀況Fig. 1 Peach seedlings treated with different concentrations of ammonium molybdate under low temperature stress

表2 低溫脅迫下不同濃度鉬酸銨處理的桃實生苗葉片凍害指數(shù)Table 2 Frost index of peach seedlings treated with different concentrations of ammonium molybdate under low temperature stress

2.4 不同濃度鉬酸銨對低溫脅迫下桃實生苗葉片相對電導率的影響

電導率是衡量桃樹植株細胞內(nèi)容物擴散到細胞外的一項生理指標，能夠反映細胞質(zhì)膜受傷害的程度。低溫脅迫下，桃實生苗葉片的相對電導率隨脅迫時間呈明顯上升的趨勢，噴施不同濃度的鉬酸銨能顯著降低桃實生苗葉片的相對電導率。0℃條件下，桃實生苗葉片的相對電導率在0～48 h均呈上升趨勢，噴施清水處理 (M0) 的相對電導率一直處于最高的水平，0.01%、0.04%、0.08%和0.12%鉬酸銨處理都能顯著降低桃實生苗的相對電導率，其中以M2處理效果最為顯著 (P〈 0.05)，相對電導率的增長幅度顯著降低，在48 h時，分別比對照降低了5.10%、7.19%、3.77%、5.03%。說明鉬酸銨處理顯著降低了桃實生苗葉片膜蛋白受傷害的程度，減少了胞質(zhì)的胞液外滲，有效地保護了細胞膜系統(tǒng)，增強了葉片的抗低溫能力 (圖3)。

2.5 不同濃度鉬酸銨對低溫脅迫下桃實生苗葉片SPAD值、凈光合速率的影響

低溫脅迫處理后，對5組桃實生苗葉片的SPAD值和凈光合速率進行統(tǒng)計分析。不同濃度鉬酸銨處理有效阻止了SPAD值及凈光合速率的降低，與M0處理相比，SPAD值分別提高了8.6%、23.4%、11.1%、8.6%；凈光合速率分別提高了9.4%、62.4%、37.6%、25.6% (圖4)，其中0.04%鉬酸銨處理效果最為明顯 (P〈 0.05)，說明0.04%處理能顯著降低低溫脅迫對桃實生苗葉片光合特性的影響。

圖2 不同濃度鉬酸銨處理桃實生苗葉片鉬含量Fig. 2 Mo contents in peach seedling leaves under various ammonium molybdate concentrations

圖3 低溫脅迫下不同濃度鉬酸銨處理的桃實生苗葉片的相對電導率Fig. 3 The relative conductivity of peach seedlings leaves treated with different concentrations of ammonium molybdate under low temperature stress

圖4 低溫脅迫下不同濃度鉬酸銨處理桃實生苗葉片SPAD值及凈光合速率Fig. 4 SPAD values and net photosynthetic rates of peach seedling leaves treated with different concentrationsof ammonium molybdate under low temperature stress

2.6 不同濃度鉬酸銨對低溫脅迫下桃實生苗葉片脯氨酸、可溶性糖含量的影響

低溫脅迫條件下，與M0處理相比，0.01%、0.04%、0.08%和0.12%鉬酸銨處理的葉片脯氨酸含量分別提高了0.89%、11.7%、8.54%、5.06%；可溶性糖含量分別提高了1.95%、9.64%、6.73%、4.50%(圖5)，其中以0.04%鉬酸銨處理效果最為明顯 (P〈0.05)。脯氨酸和可溶性糖含量與溫度變化密切關(guān)聯(lián)，其含量提高能顯著增強細胞的抗逆能力，說明鉬酸銨處理能起到調(diào)節(jié)葉片細胞滲透壓、保護膜穩(wěn)定性的作用。綜上表明，0.04%鉬酸銨處理對緩解低溫脅迫傷害的效果最佳。

2.7 不同溫度下鉬酸銨對桃實生苗葉片可溶性糖和脯氨酸含量的影響

根據(jù)上述試驗結(jié)果，進一步研究發(fā)現(xiàn)。低溫脅迫下，桃實生苗葉片的可溶性糖和脯氨酸含量較常溫條件下呈升高趨勢，0.04%鉬酸銨處理能顯著提高葉片可溶性糖和脯氨酸含量 (P〈 0.05)。由圖6所示，T1 (清水 + 0℃)、T3 (0.04% 鉬酸銨 + 0℃) 處理葉片的可溶性糖和脯氨酸 (圖6) 含量在0～48 h呈顯著上升趨勢。在24 h時，T3處理較T1處理可溶性糖含量無顯著差異，脯氨酸含量提高了8.82%；在48 h時，T3處理較T1處理可溶性糖含量提高了8.27%，脯氨酸含量提高了8.69%；CK (清水 + 常溫)、T2 (0.04%鉬酸銨 + 常溫) 處理沒有明顯變化?？扇苄蕴呛透彼崮軌蛎舾小@著地響應(yīng)低溫脅迫，0.04%鉬酸銨處理使其含量升高可提高細胞滲透勢，有利于維持細胞正常的生理活動，是植物對逆境條件的一種適應(yīng)性變化。

圖5 低溫脅迫下不同濃度鉬酸銨處理桃實生苗葉片的脯氨酸和可溶性糖含量Fig. 5 Proline and soluble sugar contents of peach seedling leaves treated with different concentrations of ammonium molybdate under low temperature stress

圖6 不同溫度下鉬酸銨對桃實生苗葉片可溶性糖和脯氨酸含量的影響Fig. 6 Effect of ammonium molybdate on soluble sugar and proline contents of peach seedling leaves under different temperatures

2.8 鉬酸銨對葉片丙二醛含量及保護酶活性的影響

丙二醛積累量是反映膜脂過氧化作用和細胞膜結(jié)構(gòu)破壞程度的一個重要指標，過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶是防止氧自由基對細胞膜傷害的關(guān)鍵酶，對清除低溫下自由基傷害起重要作用。試驗結(jié)果 (圖7)表明，0.04%鉬酸銨處理能顯著

(P〈 0.05) 降低低溫 (0℃) 脅迫條件下細胞內(nèi)MDA的積累量，提高CAT、POD、SOD活性。在24 h時，T3處理MDA含量比T1處理降低了14.6%，CAT、POD、SOD活性分別提高了1.78%、18.7%、5.24%；48 h時，T3處理MDA含量比T1處理降低了10.8%，CAT、POD、SOD活性分別提高了1.98%、11.8%、9.15%，差異顯著 (P〈 0.05)。

2.9 鉬酸銨對LOS5/ABA3表達量的影響

0.04%鉬酸銨處理能顯著提高低溫脅迫下LOS5/ABA3的表達量。在試驗24 h時，T1、T3處理表達量分別提高了1.16倍、2.76倍，T3比T1提高了2.38倍；48 h時，T1表達量降低為0.49倍，T3處理仍提高了2.54倍。相對于T1處理，T3處理后，LOS5/ABA3的表達量保持在穩(wěn)定且顯著較高的水平 (圖 8)。

2.10 鉬酸銨對P5CS1和RCI3表達量的影響

低溫脅迫下，P5CS1和RCI3表達量呈顯著上升趨勢，0.04%鉬酸銨處理能進一步提高P5CS1和CIR1表達量。低溫處理24 h時，T1、T3處理的P5CS1表達量分別提高了2.46倍、2.64倍，T3處理比T1處理提高了7.32%；T1、T3處理的RCI3表達量分別提高了1.39倍、1.50倍，T3處理比T1處理提高了7.91%。處理48 h時，T1、T3處理的P5CS1表達量分別提高了1.15倍、2.29倍，T3處理是T1處理的1.99倍；T1、T3處理的RCI3表達量分別提高了1.20倍、1.66倍，T3處理比T1處理提高了 38.3%，差異顯著 (P〈 0.05) (圖 9)。

圖7 鉬酸銨處理后不同時間丙二醛含量和過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性Fig. 7 MDA content and activities of CAT, POD and SOD after treatment of ammonium molybdate

3 討論

鉬為植物必需微量元素，在提高植物抗逆性中具有重要作用，在酸性缺鉬土壤中施用鉬肥對冬小麥具有防凍作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，對低鉬土壤生長的毛桃實生苗進行噴鉬處理可顯著增加葉片鉬含量，緩解低溫脅迫下葉片萎蔫程度，有效緩解葉綠素含量和光合速率的降低。但抗凍效果并沒有隨施鉬量的增加而逐漸增強，這可能是因為合理濃度的鉬供應(yīng)有利于提高植物體內(nèi)養(yǎng)分的吸收與征調(diào)能力及酶活性，鉬含量過高則會打破植物體內(nèi)鉬的平衡機制[23]。

圖8 0.04%鉬酸銨處理24、48小時后LOS5/ABA3的表達量Fig. 8 Expression level of LOS5/ABA3 at 24 and 48 h after treated with 0.04% ammonium molybdate

鉬只有結(jié)合鉬輔因子后才能發(fā)揮其生物有效性，因此研究編碼鉬輔因子的基因就顯得尤為重要。LOS5/ABA3作為編碼鉬輔因子硫化酶的基因，不僅參與調(diào)控醛氧化酶 (AO) 的活性，調(diào)節(jié)激素合成，還進一步調(diào)控植物抗氧化防御能力及其他抗寒基因的表達，是ABA生物合成、脅迫誘導基因表達和脅迫耐受的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[24-25]，植株在敲除LOS5基因后對逆境脅迫的敏感性增強，更加從反面證明該基因與逆境脅迫有關(guān)[16]。轉(zhuǎn)基因大豆中擬南芥LOS5/ABA3基因上調(diào)表達，提高了AO活性導致ABA積累顯著增加，提高了植株抗逆性[26]。

圖9 0.04%鉬酸銨處理24、48小時后P5CS1和RCI3的相對表達量Fig. 9 Relative expression of P5CS1 and RCI3 at 24 and 48 h after treated with 0.04% ammonium molybdate

本試驗表明，0.04%鉬酸銨處理上調(diào)了LOS5/ABA3的表達，在低溫脅迫下更為顯著，且進一步研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下0.04%鉬酸銨處理上調(diào)了P5CS1和RCI3的表達，同時葉片中脯氨酸含量及過氧化物酶活性與對照相比顯著提高。這可能是因為，一些冷誘導基因的表達受低溫脅迫的調(diào)控，同時也對水分脅迫和脫落酸 (ABA) 有響應(yīng)[27]，RCI3受到環(huán)境和內(nèi)源物質(zhì)的復雜調(diào)節(jié)[28]。LOS5 /ABA3作為ABA合成關(guān)鍵基因，它在表達上調(diào)時會在轉(zhuǎn)錄水平上影響RCI3的表達。1-吡咯啉-5-羧酸合成酶是脯氨酸合成過程中重要的催化酶，LOS5/ABA3能夠提高脯氨酸合成酶基因 的表達量，調(diào)控脯氨酸的合成，進而影響植物的抗寒性[29-30]。

植物對逆境脅迫的反應(yīng)會部分通過改變其基因表達量來實現(xiàn)，最終會導致細胞和全植物水平上的各種適應(yīng)性反應(yīng)[27,31]。本試驗表明，噴施鉬酸銨處理的桃實生苗葉片可溶性糖、脯氨酸含量顯著提高，酶活性顯著提高，與前人施鉬能夠增加冬小麥可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸的含量，提高抗氧化酶活性[3]結(jié)果相一致。這可能是因為在低溫等非生物逆境脅迫下，植物通過啟動一系列復雜的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控抗寒基因及蛋白質(zhì)表達，進而影響植物體內(nèi)各種代謝過程，最終增強植物的抗逆性[5]?？梢娿f作為植物體必需微量元素，對于調(diào)節(jié)植株激素、蛋白質(zhì)、可溶性糖和脯氨酸等內(nèi)源物質(zhì)含量，提高植株抗凍性具有重要意義。

凍害對植物的傷害主要是破壞細胞中的膜結(jié)構(gòu)，從而引起代謝失調(diào)，導致細胞間隙的水溶液濃度比細胞液低，引起細胞內(nèi)水分外滲。前人研究表明，施用鉬肥提高冬小麥葉細胞細胞器及其膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和完整性，有利于提高冬小麥膜脂肪酸的不飽和度，降低了膜脂的相變溫度，加強了膜的流動性，增強了冬小麥的抗寒力[32]。

本試驗表明，低溫脅迫下，桃實生苗葉片生理生化功能受到一定損傷，電導率呈上升趨勢，膜透性發(fā)生改變，但不同濃度鉬酸銨處理使桃實生苗葉片凍害指數(shù)、相對電導率顯著降低，以0.04%濃度效果最佳。且0.04%鉬酸銨處理的MDA含量顯著降低，CAT、POD、SOD活性顯著升高，可以迅速降低桃實生苗葉片活性氧自由基含量，增強了植物清除活性氧的能力，降低了活性氧對植物細胞的傷害。這可能是鉬酸銨處理的桃實生苗葉片的葉綠素含量和凈光合速率下降幅度得到緩解的一個重要原因。且鉬是維持葉綠體結(jié)構(gòu)必不可少的，能提高甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAP和果糖-1, 6二磷酸酶FBPase的活性，提高了凈光合速率，促進了光合作用的進行[33-34]。

綜上表明，噴施鉬酸銨處理的桃實生苗葉片，鉬輔因子硫化酶、脯氨酸合成酶、過氧化物酶編碼基因表達上調(diào)的同時，脯氨酸含量、可溶性糖含量、抗氧化酶活性等也顯著提高，說明鉬能通過調(diào)控基因的表達，進而緩解低溫脅迫對桃實生苗葉片的傷害，但鉬調(diào)控相關(guān)基因表達的機制還有待進一步研究。

4 結(jié)論

低溫脅迫下，低鉬土壤生長的桃實生苗噴施0.04%鉬酸銨，可上調(diào)抗凍相關(guān)基因LOS5/ABA3(鉬輔因子硫化酶)、P5CS(脯氨酸合成酶) 及RCI3(過氧化物酶) 的表達量，提高葉片可溶性糖、脯氨酸含量及抗氧化酶活性，緩解低溫脅迫下葉片細胞膜氧化傷害，減輕低溫脅迫對桃實生苗的傷害。