玉米脫鎂葉綠酸氧化酶基因ZmPAO表達與葉綠素含量動態(tài)變化的關聯(lián)分析

韋寧寧，聶佳偉?，王亞輝，李 婷，趙志鑫，張興華，薛吉全，徐淑兔*

（1 西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院/農(nóng)業(yè)部西北旱區(qū)玉米生物學與遺傳育種重點試驗室，楊凌，712100；2 陜西省玉米工程技術研究中心，楊凌，712100）

葉綠素是自然界最重要的光合色素之一，植物中的葉綠素主要為葉綠素a和葉綠素b[1]，以激發(fā)形式將光子能量轉(zhuǎn)變成化學能[2]。在籽粒成熟后期，有效的葉綠素分解可以促進營養(yǎng)物質(zhì)向貯存器官轉(zhuǎn)移,是制約玉米產(chǎn)量進一步提高的重要因素[3-4]。挖掘成熟后期的玉米脫鎂葉綠酸氧化酶基因 (ZmPAO) 的有效變異位點有助于理解葉綠素的代謝機制，為玉米分子遺傳育種提供一定的理論基礎。

自從Hendry等35年前提出葉綠素降解是生物學之謎后[5]，葉綠素降解機制得到了不斷發(fā)展。在模式植物擬南芥中，葉綠素代謝通路通過分子生物學，生理學和代謝組學等手段已經(jīng)逐漸明晰[6-8]。植物體內(nèi)的葉綠素水平主要由葉綠素循環(huán)[9-10]和葉綠素降解[11-12]所調(diào)節(jié)。研究認為“PAO”途徑完全決定了葉綠素酶促降解過程，葉綠素b通過向葉綠素a的轉(zhuǎn)化[13]，進而實現(xiàn)葉綠素b的唯一降解途徑[14]。葉綠素a的分解始于被葉綠素酶 (CLH) 催化形成脫植基葉綠素，再由一個金屬螯合物脫去鎂離子形成脫鎂葉綠酸a (pheide a)，然后通過脫鎂葉綠酸氧化酶(PAO)，葉綠素酶 (RCC) 開啟了卟啉環(huán)的裂解，再通過紅色葉綠素代謝產(chǎn)物還原酶 (RCCR) 進一步分解，生成初生熒光葉綠素代謝產(chǎn)物 (pFCC)[15-17]，并最終經(jīng)過幾次修飾之后運輸至液泡中轉(zhuǎn)化為非熒光的葉綠素分解代謝物 (NCC)[18](圖1)。這些酶蛋白的結構在20多種植物都得到了分離和鑒定[19-21]。

在擬南芥中，PAO突變體曾被定義為加速細胞死亡1 (ACD1)[22]，PAO的表達有助于擬南芥抵抗針葉假單胞菌的感染[23]。在過去的20年里，Kr?utler等人第一次闡述了葉綠素代謝在藻膽素中的相關結構[24]和后續(xù)調(diào)解機制[25]。通過后續(xù)鑒定得到了一種打開脫鎂葉綠酸a卟啉環(huán)的加氧酶PAO[26]，其C端跨膜結構域被定位在類囊體膜上[27]，是“PAO”代謝途徑的重要酶[28-29]。作為葉綠素降解關鍵基因，挖掘脫鎂葉綠酸氧化酶 (PAO) 基因中與玉米成熟后期葉綠素組分含量的有利變異位點對解析玉米葉片衰老具有重要意義。因此，本研究以源自陜A群、陜B群選育的自交系和國內(nèi)骨干自交系共141份玉米自交系為材料，開展ZmPAO基因序列分析和該基因與成熟后期葉綠素組分含量的關聯(lián)分析，擬找到ZmPAO的有效功能位點，為解釋該基因結構提供一定的研究基礎，可以提高我們對控制葉綠素含量變異這一數(shù)量性狀的遺傳機制的理解，以服務功能保綠型的玉米分子育種。

圖1 葉綠素代謝通路圖Fig. 1 Chlorophyll metabolic pathway

1 材料與方法

1.1 試驗材料與田間種植

本試驗研究材料來自于西北農(nóng)林科技大學提供的141份玉米自交系(來自A、B兩個自交系群體)。試驗于2017年在西北農(nóng)林科技大學榆林綜合試驗站和楊凌綜合試驗站進行。試驗采取隨機區(qū)組實驗設計，每個自交系種植2行，行長5 m，行距60 cm，種植密度75000 株/hm2，3次重復，正常田間澆水管理。

1.2 表型測定與分析

在玉米開花后20天(T1)起開始取樣，依次為T2 (開花后 26天)、T3 (開花后 32天)、T4 (開花后38 天)、T5 (開花后 44 天)、T6 (開花后 50 天) 和 T7(開花后56天)。取樣過程為用直徑0.6 cm的打孔器從兩地隨機取每小區(qū)生長狀況一致的玉米穗位葉中部10枚圓片放入2 mL離心管，各做3個重復，立即與1 mL 95%乙醇混合。在4 ℃黑暗條件下處理48 h，用分光光度計 (Bio-RAD，上海，中國) 測葉綠素提取上清液在645 nm和663 nm的波長處的吸光度，取3個重復的平均值為最終葉綠素含量。

Chl. a和Chl. b的計算采用Arnon[30]提出的下列公式：

所有數(shù)據(jù)分析使用JMP 10軟件[31]和Microsoft Excel。

1.3 ZmPAO基因克隆

模式植物擬南芥葉綠素代謝通路及相關基因的功能已有較好的研究基礎，因此本研究通過擬南芥基因數(shù)據(jù)庫 (https：//www.arabidopsis.org/) 搜索關鍵詞PAO，根據(jù)基因注釋信息確定AT3G44880是葉綠素代謝中的關鍵氧化還原酶。利用擬南芥中該基因蛋白序列信息在EnsemblPlants網(wǎng)站 (http：//plants.ensembl.org/index.html) 比對玉米基因組序列信息利用tBLASTn，通過控制E值 (E value ≤ 3.8E-6) 得到玉米中脫鎂葉綠酸氧化酶同源基因Zm00001d027656，命名為ZmPAO。

1.4 序列分析

通過使用改良的CTAB方法[32]從141個玉米自交系的4葉期幼苗的新鮮葉中提取基因組DNA。使用分光光度計Nanodrop 2000 (Bio-Rad公司，上海，中國) 和1%的凝膠電泳確定濃度和質(zhì)量。以參考基因組 B73 (http：//www.maizesequence.org) 提供的ZmPAO基因序列為基礎通過primmer 3.0 (http：//primer3.ut.ee/) 在線應用設計和篩選引物，用于關聯(lián)分析中的該基因的重測序?；驕y序結果使用Muscle (http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/musc) 和BioEdit進行多序列比對。

1.5 關聯(lián)分析

對實驗室已有的141份材料的簡化全基因組序列使用STRUCTRE估算玉米自交系的群體結構。使用SPAGeDi計算相對親緣關系矩陣[33]。使用TASSEL[34]提取141個玉米品系中具有最小等位基因頻率 (MAF) ≥ 0.05的ZmPAO基因中的SNPs和InDels位點。根據(jù)TASSEL計算兩個位點之間的連鎖不平衡情況 (LD)[34]，排除顯著連鎖 (R2〉 0.2) 的位點，以各時期各個材料的葉綠素組分含量為表型數(shù)據(jù)，篩選最顯著的位點以挖掘該基因有效功能位點并進行性狀的單倍型分析[35]。

2 結果與分析

2.1 葉綠素組分含量基本統(tǒng)計分析

在榆林和楊凌試驗站正常管理下，對141份玉米自交系在7個取樣時間點的葉綠素組分含量通過使用JMP 10軟件進行了基本統(tǒng)計分析。相關性分析結果 (圖2) 表明，在同一地點同一時期葉綠素a和葉綠素b的相關性為0.956，只有榆林的花后44天和楊凌的花后38天的相關系數(shù)相對較低，分別為0.303和0.527。不同地點或不同時期間的葉綠素a和葉綠素b的正相關性較低，說明葉綠素組分含量間的密切程度較低，有較大的獨立變化性。這也說明了葉綠素組分含量受環(huán)境和基因型的影響較為敏感，處于時刻變化中。除榆林試驗站的花后26天和楊凌試驗站的花后26天和38天的葉綠素組分含量的峰度和偏度較大外，其他葉綠素組分含量基本符合正態(tài)分布 (表1)，表明葉綠素含量是數(shù)量性狀，其測定值可用于后續(xù)關聯(lián)分析。

圖2 榆林和楊凌地區(qū)7個取樣時期玉米穗位葉葉綠素a和葉綠素b含量的相關性分析Fig. 2 Correlation of chlorophyll a and b contents at the seven sampling periods in Yulin and Yangling regions

2.2 不同取樣時期葉綠素組分含量變化分析

楊凌和榆林試驗站正常田間管理下，7個取樣時期141份材料的葉綠素a和葉綠素b含量平均值的系列波動說明了玉米在成熟后期葉綠素的動態(tài)變化和衰老過程。榆林在開花后38天總?cè)~綠素含量最高為4.58 mg/L，開花后56天最低為3.09 mg/L，差異為48.22%；楊凌處理在開花后44天總?cè)~綠素最高含量為4.52 mg/L，開花后26天最低為3.05 mg/L，差異為48.19%，開花后56天的總?cè)~綠素含量仍較高，為3.82 mg/L。這一變化說明榆林和楊凌地區(qū)在玉米成熟后期的總?cè)~綠素變化幅度基本一致，主要由材料本身決定；不同的是楊凌比榆林的玉米生育期長，葉綠素合成和降解速度較慢。圖3的葉綠素組分變化結果表明，玉米成熟后期葉綠素a含量普遍低于葉綠素b含量，并不符合傳統(tǒng)3∶1的比值；后期葉綠素b均呈下降趨勢，說明葉綠素b可能正通過向葉綠素a轉(zhuǎn)化實現(xiàn)自身降解；除此之外，取樣后期的總?cè)~綠素含量也在降低。玉米成熟后期，總?cè)~綠素的降解在普遍發(fā)生，進一步表明葉綠素代謝關鍵基因ZmPAO可能起著重要的作用，符合關聯(lián)分析對于葉綠素代謝過程的要求。

2.3 ZmPAO的核苷酸多樣性

ZmPAO有兩個轉(zhuǎn)錄本Zm00001d027656_T001和Zm00001d027656_T002。前者氨基酸序列較長，由七個外顯子組成，外顯子跨越染色體1上的4349 bp∶10，261，506-10，265，855 (圖 4)，它含有2131 bp的CDS長度，編碼520個氨基酸序列，故以其進行序列分析。通過PCR (聚合酶鏈式反應)擴增、產(chǎn)物電泳檢測與測序分析最終篩選了6對引物用于141份自交系群體目的基因的測序 (引物序列詳見表2，引物所在基因位置詳見圖4)。通過141份玉米自交系ZmPAO的重測序和多重序列比對，共檢測到108個多態(tài)位點。它包括72個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP) 位點和36個插入缺失 (insertion/deletion，InDel) 位點，平均每40 bp區(qū)間內(nèi)檢測到一個多態(tài)位點。ZmPAO的核苷酸多樣性分布不均，第3內(nèi)含子的核苷酸多樣性水平最高 (表 3)。

表1 榆林和楊凌玉米各取樣時期葉綠素a和b含量的群體特征 (mg/L)Table 1 Population characteristics of chlorophyll a and b contents in Yulin and Yangling regions

圖3 榆林和楊凌玉米花后7個取樣期穗位葉葉綠素含量Fig. 3 Contents of chlorophyll a and b in the seven sampling periods in Yulin and Yangling

2.4 ZmPAO與葉綠素組分含量的有效關聯(lián)位點分析

利用群體結構和親緣關系為基礎的混合線性模型對已鑒定的多態(tài)位點和各時期葉綠素含量進行關聯(lián)分析。經(jīng)LD分析，該基因108個多態(tài)性位點中有19個(13個SNPs和6個Indels)與葉綠素化合物顯著相關 (P〈 0.05)，有12個多態(tài)性位點與兩個或更多的性狀相關。在19個位點中，1個SNP位點位于3′UTR，14個變異位點位于內(nèi)含子區(qū)域；只有4個SNP位點位于外顯子區(qū)域，其中有2個引起了氨基酸的變化 (丙氨酸A-蘇氨酸T，脯氨酸P-絲氨酸S)，且都為疏水氨基酸到親水氨基酸的變化 (表3)。這說明ZmPAO基因?qū)τ谌~綠素的影響既存在蛋白水平的調(diào)控也存在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。

榆林點關聯(lián)分析共找到12個顯著變異位點(6個SNPs和6個Indels)，有趣的是所有的Indels位點都對其葉綠素組分含量起一定的作用，其中SNP位點S528、S545、S1390和Indel位點S1144對于同時期的葉綠素a和葉綠素b都存在貢獻，但花后32天和38天沒有找到相關有效變異位點。變異位點對于葉綠素組分含量的表型解釋率在3.89%～8.70%，分別作用于花后56天的葉綠素b和26天的葉綠素a。以作用于花后20天和56天的葉綠素組分表型變異的關聯(lián)位點數(shù)較多，為5個 (2個SNPs和3個Indels) 和4個 (2個SNPs和2個Indels)；花后20天的葉綠素a的表型總解釋率高達25.77%，同時期葉綠素b的表型總貢獻率為19.16%；花后56天的葉綠素a和葉綠素b的表型總解釋率分別為9.98%和18.11%。其他時期以1個變異位點為主，花后26天的SNP位點S528 (G/A) 對葉綠素a和葉綠素b分別有8.7%和6.77%的表型貢獻；花后44天的Indel位點S996解釋了8.09%的葉綠素b表型變異；花后50天的SNP位點S3232 (A/C) 和Indel位點S3235分別解釋葉綠素a的4.92%和6.41%變異。

圖4 ZmPAO的基因結構Fig. 4 Structure of gene ZmPAO

表2 ZmPAO基因的引物序列Table 2 Primer sequences for re-sequencing of ZmPAO gene using PCR

楊凌點關聯(lián)分析結果共找到11個有效變異位點(9個SNPs和2個Indels)。各時期葉綠素a和葉綠素b表型變異相關的各有8個變異位點，其中SNP位點S3182和S3227分別只對開花后44天和56天的葉綠素a起到5.24%和9.40%的效應，SNP位點S3569以及Indel位點S3235只與花后50天的葉綠素b相關，表型總效應高達23.23%。花后26天和50天的葉綠素組分含量各有5個相關變異位點，有趣的是對葉綠素b表型變異都有較高總解釋率，分別為18.48%和35.36%，與葉綠素a的效應相對較低 (前者為6.13%，后者為6.42%)。花后20天和38天都各有一個相關變異位點，分別為SNP位點S3675和S3817，其中S3675的效應值相對較大，均在12%以上。花后32天的SNP位點S1001、S1352、S1602對葉綠素b表型變異的效應值均為7.73%。

選取榆林開花后20天的葉綠素b等表型性狀的顯著關聯(lián)位點進行單倍型分析 (表4)，結果表明同一性狀的不同單倍型在陜西A、B群中的差異性并不相同，榆林花后20天葉綠素b的單倍型1在B群中表現(xiàn)突出，而單倍型2恰好相反。但楊凌花后26天葉綠素b的兩種單倍型間存在顯著差異，在A群中的表型性狀普遍較高，其中單倍型2的有效位點與表3中的變異位點偏好相同。榆林花后56天葉綠素a的單倍型1和2間的差異顯示具體位點堿基缺失對于表型性狀可能有利，榆林花后20天葉綠素b的單倍型2和3中也有同樣發(fā)現(xiàn)。

3 討論與結論

表3 榆樹和楊凌區(qū)各取樣時期玉米葉綠素a和b的關聯(lián)分析Table 3 Correlation of chlorophyll a and b in different stages of maize in Yulin and Yangling regions

已有研究表明依靠作物全生育期光能利用率的提高可以進一步提高作物產(chǎn)量[36]。玉米生長后期是玉米產(chǎn)量形成的關鍵時期，人們以生育后期保持較高的葉綠素含量為標準選育長效光合持續(xù)期的品種取得一定進展[37]。植物葉綠素含量直接影響作物后期的光合作用和物質(zhì)向果實的運輸積累，干旱脅迫下對于作物的生存和產(chǎn)量形成更為重要[38-39]。隨著技術的研究，關聯(lián)分析的應用加快了復雜數(shù)量性狀遺傳機理的研究，但是關于玉米中葉綠素代謝相關功能等位基因的報道很少,大量的研究基于QTL初定位，明確了影響葉綠素代謝的區(qū)段，但未能找到真正的有效功能位點[40-43]。為此，通過研究葉綠素代謝通路的關鍵酶PAO的具體變異位點具有一定的創(chuàng)新性，以關聯(lián)分析確定顯著效應位點為后期該基因功能位點編輯提供分子基礎。

表4 性狀顯著變異位點的單倍型分析Table 4 Haplotype analysis of significantly varied loci in traits

本研究以西北農(nóng)林科技大學141個玉米自交系的兩個環(huán)境7個時期葉綠素組分含量為表型數(shù)據(jù)挖掘ZmPAO基因的功能位點。結果顯示，葉綠素b的含量都明顯高于同時期的葉綠素a的含量，不符合植物葉片葉綠素a∶b為3∶1[44]，這可能與玉米成熟后期葉綠素a的降解快于葉綠素b向葉綠素a的轉(zhuǎn)化速度有關。另外，榆林地區(qū)的總?cè)~綠素變化幅度和楊凌地區(qū)相似，但楊凌的材料相對持綠性更久，可能與兩地的播期相關 (榆林為玉米春播區(qū)、楊凌為夏播區(qū))，后者的前期生長時間較短，故授粉后44天楊凌的葉綠素各組分含量普遍高于榆林，總體呈下降趨勢。

關聯(lián)結果表明，有8個有效多態(tài)位點 (4個SNPs和4個Indels) 只與榆林地區(qū)的葉綠素組分含量變異相關，其中SNP位點S528、S545和S1390以及Indel位點S1144對同時期葉綠素a和葉綠素b都存在效應；有7個SNPs只對楊凌的葉綠素組分含量變異具有貢獻效應。剩下的4個變異位點 (2個SNPs和2個Indels) 對兩地葉綠素組分含量變異都存在作用，說明這些位點的效應可能存在普遍性，后期需要進一步進行驗證。對于楊凌各時期的葉綠素組分變異的總效應值分布普遍高于榆林地區(qū)，前者總效應值最高的是花后50天葉綠素b的41.78%總表型解釋率，后者最高的是花后20天的葉綠素a的25.77%的總貢獻率。性狀單倍型分析的有利位點與關聯(lián)分析顯著位點的偏好一致，說明MLM模型的關聯(lián)分析結果具有可靠性。本研究發(fā)現(xiàn)ZmPAO基因中與玉米成熟后期穗位葉葉綠素組分含量相關的有效關聯(lián)位點多以非氨基酸變異位點為主，氨基酸變異位點S528和S545都只與榆林地區(qū)花后26天和56天的葉綠素組分變異相關。這些現(xiàn)象的出現(xiàn)可能基于以下原因：1) 試驗使用的是B73參考基因組中的ZmPAO序列，與141份材料的實際基因序列相比可能存在結構劃分的不同，特別是可變剪切[45]現(xiàn)象的存在，導致一些DNA序列被誤認為并不起編碼作用；2) 基因調(diào)控除了蛋白水平的調(diào)控還存在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，本研究測序基因范圍可能未將真正的功能位點涵蓋，需要更深入的研究；3) 內(nèi)含子變異不僅能參與結構基因的再剪接，也能參與啟動子啟動活性和啟動子內(nèi)含的暗誘導元件誘導活性的調(diào)節(jié)[46]，特別是3′UTR處S3817的SNP位點可能影響相應的miRNA的結合強度[47]而調(diào)控基因表達。

本研究結果對進一步解析玉米葉綠素代謝機理有重要的指導意義，為玉米成熟后期適度衰老品種的創(chuàng)造提供遺傳機制，但不易排除葉綠素含量其他相關基因的作用；后期可以通過組學手段研究該基因的表達調(diào)控網(wǎng)絡，從而在全基因組表達水平揭示其基因功能，輔助玉米分子育種。