兩親性大分子季銨鹽對(duì)水稻紋枯病菌抑菌活性表征方法研究

董辰韻，常瑤瑤，鐘偉強(qiáng)，張安強(qiáng)，林雅鈴

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院，廣東 廣州 510642；2. 華南理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641）

【研究意義】水稻紋枯病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的一種制約水稻生產(chǎn)的重要真菌病害［1-2］，目前化學(xué)藥劑防治仍是最重要的防治手段［3-5］。季銨鹽是一種廣譜性滅菌劑，常應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的消毒滅菌，對(duì)微生物有良好的抑菌和殺菌效果。大分子季銨鹽不僅具有小分子季銨鹽良好的抑菌活性，還可克服小分子季銨鹽易揮發(fā)、穩(wěn)定性差和環(huán)境毒性強(qiáng)等弱點(diǎn)［6］，將其應(yīng)用于微生物的抑制是當(dāng)今研究和開(kāi)發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)［7］。兩親性大分子季銨鹽是一種分子鏈中同時(shí)含有親水鏈段和疏水鏈段的高分子聚合物，能通過(guò)親疏水作用穩(wěn)定吸附于固體材料表面，并降低水在材料表面的張力，故也被認(rèn)為是一種廣義的表面活性劑。臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）是針對(duì)膠束系統(tǒng)而言的，當(dāng)溶液中存在的聚合物（通常為表面活性劑兩親性分子）開(kāi)始大量形成膠束時(shí)的濃度即為CMC。當(dāng)聚合物在溶液中的濃度高于CMC時(shí)，聚合物就會(huì)自發(fā)聚集形成膠束，而當(dāng)濃度低于CMC時(shí)，自由的聚合物鏈不易形成穩(wěn)定的膠束。其中兩親性聚合物的膠束CMC一般在10-6mol/L，而小分子的表面活性劑的CMC則大約為10-3mol/L［8］。因此，兩親性聚合物在水溶液中的溶解性不如兩親性小分子化合物，前者更易在溶液中形成膠束，而這類(lèi)在溶液中易形成膠束的兩親性大分子季銨鹽對(duì)病原真菌抑菌活性的表征方法及效果，目前還鮮有報(bào)道?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究化合物對(duì)病原微生物抑菌活性的方法有多種。對(duì)病原細(xì)菌的表征方法有抑菌圈法［9］、管碟法［10］、濾紙片法［11］等。對(duì)病原真菌的表征方法有生長(zhǎng)速率法［12-16］、菌絲稱(chēng)重法［17］、孢子萌發(fā)法［18-19］等，其中生長(zhǎng)速率法因其操作簡(jiǎn)單，結(jié)果直觀而應(yīng)用廣泛，但其只適用于在培養(yǎng)基中溶解性好且分布均勻的化合物表征；菌絲稱(chēng)重法適用于能在培養(yǎng)基中溶解的化合物表征；而孢子萌發(fā)法只適用于能產(chǎn)生孢子的病原真菌?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】分別利用生長(zhǎng)速率法和菌絲稱(chēng)重法對(duì)3種不同結(jié)構(gòu)的季銨鹽，即一種新型兩親性大分子季銨鹽〔聚二甲基硅氧烷-b-聚丙烯酸酯季銨鹽嵌段共聚物，PDMS-b-(PDMAEMA-BCA)，簡(jiǎn)稱(chēng)Six-Q5〕、親水性大分子季銨鹽（PQD-BC）和小分子季銨鹽（BC）對(duì)水稻紋枯病菌（R. solani）抑菌活性進(jìn)行系統(tǒng)表征，比較了兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】探索出適用于兩親性大分子季銨鹽對(duì)植物病原真菌的抑菌活性表征方法，為高分子季銨鹽作為植物病原真菌殺菌劑開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn AG-1(IA)），由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理學(xué)系真菌實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

苯扎氯銨（十二烷基二甲基芐基氯化銨，BC），99%，上海麥克林公司提供；聚二甲氨基丙基甲基丙烯酰胺-芐基氯化銨（PQD-BC），按文獻(xiàn)［1］采用自由基聚合方法合成，平均相對(duì)分子量為1.5×105；PDMS-b-(PDMAEMA-BC)的化學(xué)名稱(chēng)為聚二甲基硅氧烷-b-聚(二甲氨基丙基甲基丙烯酸酯-芐基氯化銨)嵌段共聚物，是一類(lèi)新型兩親性大分子季銨鹽（Six-Q5，x = 0、2、3、4、5、8、10），按文獻(xiàn)［20］采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合方法（ATRP）合成，其結(jié)構(gòu)參數(shù)見(jiàn)表1。

PD培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基按文獻(xiàn)［21］的方法配置。

表1 Six-Q5的結(jié)構(gòu)參數(shù)Table1 Structural parameters of Six-Q5

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生長(zhǎng)速率法測(cè)試季銨鹽對(duì)R. solani的抑菌活性 將保留的R. solani菌絲接種于PDA平板中，倒置，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后，在菌落邊緣打取6 mm菌碟，移至新的PDA平板，在相同溫度下培養(yǎng)2 d。在超凈工作臺(tái)中，配制不同濃度的季銨鹽（Six-Q5、PQD-BC和BC）溶液5 mL，倒入已融化的PDA培養(yǎng)基中，使其終濃度范圍在0.1～1 mg/mL，待培養(yǎng)基凝固后，向含藥PDA平板中央移接入從活化菌種邊緣打取的菌碟，28 ℃培養(yǎng)30 h，每個(gè)處理3次重復(fù)。用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算相對(duì)抑制率：

1.2.2 菌絲稱(chēng)重法測(cè)試季銨鹽對(duì)R. solani的抑菌活性 按照1.2.1實(shí)驗(yàn)方法活化R. solani，在菌落邊緣打取菌碟移至45 mL PD培養(yǎng)基中，每瓶移接2個(gè)菌碟，28 ℃、120 r/min搖床中培養(yǎng)3 d，即可得到菌液。

在超凈工作臺(tái)中，稱(chēng)取適量季銨鹽，紫外滅菌20 min后，用PD稀釋成一系列不同濃度，定容至8 mL，以相同體積的PD作為對(duì)照。于活化好的菌液中挑取適量菌絲，勻漿制成菌懸液（3×106～ 3×107CFU/mL），分別加入2 mL混勻的菌懸液于上述配制好的不同濃度的季銨鹽溶液中，混勻，置于28℃、150 r/min下培養(yǎng)48 h。

通過(guò)減重法，先將標(biāo)記好的稱(chēng)量瓶（含兩張定量濾紙）置于80℃下烘干3 h后，風(fēng)干至室溫，稱(chēng)得稱(chēng)量瓶（含濾紙）質(zhì)量（M1）；然后將對(duì)應(yīng)標(biāo)記的稱(chēng)量瓶中的濾紙置于布氏漏斗中抽濾培養(yǎng)48 h菌藥混合液，并用PBS沖洗菌絲2次，洗去菌絲表面附著的季銨鹽，放回容量瓶中，再置于80℃下烘干3 h，風(fēng)干至室溫，稱(chēng)得稱(chēng)量瓶（含濾紙）及菌絲的質(zhì)量（M2），用減重法測(cè)量菌絲質(zhì)量，計(jì)算相對(duì)抑制率：

式中，菌絲質(zhì)量（g）= M2- M1。

1.2.3 毒力方程 以濃度對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，根據(jù)《生物統(tǒng)計(jì)機(jī)率值換算表》，把抑制百分率換算成生物幾率值作為縱坐標(biāo)，繪制毒力回歸方程。利用方程求得幾率值為5時(shí)的質(zhì)量濃度即為IC50，幾率值為6.28155時(shí)的質(zhì)量濃度為IC90。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)速率法測(cè)試季銨鹽對(duì)R. solani的抑菌活性

半數(shù)抑制濃度（IC50）是指能抑制50 %病原微生物生長(zhǎng)的藥物濃度，90 %抑制濃度（IC90）則是指抑制90% 病原微生物生長(zhǎng)的藥物濃度［22］。IC50和IC90通常是用來(lái)評(píng)價(jià)化合物對(duì)病原微生物的抑菌活性。

圖1 Six-Q5季銨鹽對(duì)R. solani抑菌活性的菌落狀況Fig.1 Typical mycelial growth of R. solani in PDA medium treated with Six-Q5 quaternary ammonium salts

圖1是經(jīng)過(guò)Six-Q5季銨鹽在不同濃度處理下生長(zhǎng)2 d的R. solani菌落，由圖1可見(jiàn)，對(duì)比空白對(duì)照，各處理的R. solani菌落直徑明顯減小，說(shuō)明經(jīng)過(guò)季銨鹽處理，R. solani的生長(zhǎng)受到了抑制。然而不同類(lèi)型的季銨鹽對(duì)R. solani生長(zhǎng)的抑制效果不同。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，PQDBC和BC處理的菌落直徑隨著處理濃度的增加而減?。?3］，但采用同樣的實(shí)驗(yàn)方法用于Six-Q5對(duì)R. solani抑菌活性的表征時(shí)，其結(jié)果則出現(xiàn)了顯著的偏差：Six-Q5處理的樣品處理濃度對(duì)數(shù)值與計(jì)算所得的生物幾率值不呈線(xiàn)性關(guān)系，其結(jié)果見(jiàn)圖2。

通過(guò)采用生長(zhǎng)速率法測(cè)量3類(lèi)季銨鹽對(duì)R.solani抑菌活性的相關(guān)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)PQD-BC和BC處理的擬合曲線(xiàn)擬合效果較好（r2＞ 0.95），分別為：y= 3.08x+ 9.04（r2= 0.960，IC50= 730 μg/mL，IC90= 1640 μg/mL）和y= 3.63x+ 5.50（r2= 0.964，IC50= 48.0 μg/mL，IC90= 127 μg/mL）。然而，Six-Q5處理的數(shù)據(jù)擬合效果不好（r2介于0.52～0.92之間，如圖2所示），說(shuō)明通過(guò)擬合方程計(jì)算得到的IC50和IC90可信度不高，不適宜評(píng)價(jià)Six-Q5對(duì)R. solani的相對(duì)抑菌活性。

圖2 生長(zhǎng)速率法測(cè)Six-Q5系列 (A～G)、PQD-BC (H)和BC (I)對(duì)R. solani抑菌活性擬合曲線(xiàn)Fig.2 Fitting curves of antibacterial activity of Six-Q5 series (A-G), PQD-BC (H) and BC (I) to R. solani by growth rate method

2.2 菌絲稱(chēng)重法測(cè)試季銨鹽對(duì)R. solani的抑菌活性

由于生長(zhǎng)速率法不能較好地表征兩親性大分子季銨鹽的抑菌活性，試驗(yàn)嘗試了另一種方法，即菌絲稱(chēng)重法［17］。

圖3為利用菌絲稱(chēng)重法測(cè)量的菌絲干重計(jì)算得到的樣品處理濃度對(duì)數(shù)-生物幾率值的擬合曲線(xiàn)，由圖3可見(jiàn)，3類(lèi)不同結(jié)構(gòu)的季銨鹽處理的濃度-生物幾率值擬合曲線(xiàn)的擬合效果較好（r2＞ 0.96）,說(shuō)明可以通過(guò)擬合曲線(xiàn)方程計(jì)算得到IC50和IC90（表2），且其可信度較高，可以用來(lái)評(píng)價(jià)3類(lèi)不同結(jié)構(gòu)季銨鹽對(duì)R. solani抑菌活性的大小。由表2可見(jiàn)，PDMS嵌段長(zhǎng)度較長(zhǎng)的Si8-Q5和Si10-Q5對(duì)R. solani的抑菌活性明顯弱于其余PDMS嵌段長(zhǎng)度較短的Six-Q5（x= 0～5）和PQD-BC及BC，可能是因?yàn)楫?dāng)聚合物的親水段長(zhǎng)度不變時(shí)，疏水段長(zhǎng)度越長(zhǎng)，聚合物的CMC越小，其在培養(yǎng)液中的溶解度降低，影響測(cè)試的IC50及IC90的準(zhǔn)確性。

圖3 菌絲稱(chēng)重法測(cè)Six-Q5 (A～G)、PQD-BC (H)和BC (I)對(duì)R. solani抑菌活性擬合曲線(xiàn)Fig.3 Fitting curves of antibacterial activity of Six-Q5 series (A-G), PQD-BC (H) and BC (I) to R. solani by mycelium weighing method

表2 基于菌絲稱(chēng)重法測(cè)得3類(lèi)季銨鹽對(duì)R. solani抑菌活性的相關(guān)參數(shù)Table2 Parameters of the antimicrobial activity of three kinds of quaternary ammonium salts against R. solani measured by mycelial weighing method

3 討論

3.1 生長(zhǎng)速率法測(cè)試季銨鹽對(duì)R. solani的抑菌活性

用電導(dǎo)率法測(cè)得Six-Q5的臨界膠束濃度（CMC）的結(jié)果介于0.06～0.09 mg/mL之間，說(shuō)明Six-Q5在水溶液中易于形成膠束，且膠束的尺寸較大，用透射電鏡測(cè)試的結(jié)果為50～500 nm。當(dāng)在固體培養(yǎng)基中Six-Q5終濃度為0.1～1 mg/mL時(shí)，大于CMC，則形成膠束［8］，在固體培養(yǎng)基甚至靜置液體培養(yǎng)基中難以均勻分布，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致同一處理不同重復(fù)的結(jié)果波動(dòng)較大；而親水性大分子季銨鹽（PQD-BC）和小分子季銨鹽（BC）在液體和固體中均能分布均勻，容易實(shí)現(xiàn)較為穩(wěn)定的重復(fù)結(jié)果。這應(yīng)該是生長(zhǎng)速率法不適合兩親性大分子季銨鹽的抑菌活性表征的主要原因。

3.2 兩種方法測(cè)得季銨鹽對(duì)R. solani的抑菌活性比較

菌絲稱(chēng)重法測(cè)試的PQD-BC及BC的IC50和IC90明顯小于生長(zhǎng)速率法測(cè)得的結(jié)果，這可能和菌絲與樣品有效接觸面積有關(guān)。生長(zhǎng)速率法中，菌碟只有一面緊挨毒平板，則只有貼著毒平板生長(zhǎng)的菌絲會(huì)受到抑制，毒平板中的藥物難以抑制氣生菌絲的生長(zhǎng)；而菌絲稱(chēng)重法中，菌碟和菌絲是完全浸潤(rùn)于藥物溶液中，且振蕩培養(yǎng)增加了藥物與菌絲的有效接觸頻率，從而增強(qiáng)了抑制效果，致使菌絲稱(chēng)重法測(cè)試得到的IC50和IC90會(huì)比生長(zhǎng)速率法的測(cè)試值小。

前期關(guān)于聚丙烯酸酯季銨鹽均聚物（PDMAEMA-BC）的研究發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)聚合物的分子質(zhì)量適當(dāng)時(shí)（約為5 000 u，相當(dāng)于本試驗(yàn)中的Si0-Q5）才能獲得較佳的抑菌活性。但在本試驗(yàn)中，雖然發(fā)現(xiàn)兩親性大分子季銨鹽（Six-Q5）分子結(jié)構(gòu)中親疏水嵌段的比例對(duì)其抑菌活性有較大影響，通過(guò)調(diào)整疏水的PDMS嵌段長(zhǎng)度（約為5 000 u）可以獲得與小分子季銨鹽相當(dāng)抑菌活性的兩親性大分子季銨鹽，但PDMS嵌段長(zhǎng)度與抑菌活性之間的規(guī)律性不甚明顯，相關(guān)機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

生長(zhǎng)速率法適用于在培養(yǎng)基中溶解性好、且分布均勻的化合物抑菌活性的表征。而像Six-Q5這類(lèi)在水溶液中易于形成膠束，且膠束的尺寸較大的大分子化合物的抑菌活性表征則更適宜采用菌絲稱(chēng)重法。