血小板膜糖蛋白CD41/CD61基因多態(tài)性及其表達(dá)率與動(dòng)脈粥樣硬化性急性腦梗死的關(guān)系

陳云 周元林 蔣輝華 柯紹發(fā) 陳葆國 朱敏 韓文勝

腦梗死是由各種原因致局部腦組織血液供應(yīng)障礙而發(fā)生的缺血、缺氧性壞死，具有高發(fā)病率、高致殘率，嚴(yán)重危害人類健康；其最常見的病因是動(dòng)脈粥樣硬化。血小板作為動(dòng)脈斑塊、血栓形成過程中不可或缺的成分，參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、血栓栓塞形成的各個(gè)環(huán)節(jié)?；罨癄顟B(tài)下的血小板膜糖蛋白CD41/CD61復(fù)合物能表達(dá)多種血小板受體功能，與纖維蛋白原、血管性血友病因子、纖維連接蛋白等粘連性蛋白結(jié)合形成異二聚體，使血小板黏附、聚集，在動(dòng)脈粥樣硬化性急性腦梗死的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用[1]。本研究通過檢測(cè)162例動(dòng)脈粥樣硬化性急性腦梗死患者和131例健康體檢者血小板膜糖蛋白CD41/CD61基因多態(tài)性及其表達(dá)率，探討血小板膜糖蛋白CD41/CD61基因多態(tài)性及其表達(dá)率與動(dòng)脈粥樣硬化性急性腦梗死的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2015年6月至2016年9月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的首次腦梗死患者162例（腦梗死組），其中男82例，女80例；年齡41～85（63.39±10.79）歲。所有患者均符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，且全部經(jīng)頭顱MRI確診為急性腦梗死，其病因?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化。選擇同期在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院體檢中心體檢的無各類心腦血管及外周血管病史的健康者131例作為對(duì)照組，其中男 63 例，女 68 例；年齡 36～84（60.20±9.38）歲。兩組性別、年齡、吸煙史、飲酒史、TG、TC、HDL、LDL、糖化血紅蛋白、超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），但兩組高血壓史、2型糖尿病史、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、同型半胱氨酸、ESR水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。排除標(biāo)準(zhǔn)：腦出血、顱內(nèi)感染、急性心肌梗死、心房顫動(dòng)、心臟瓣膜病、嚴(yán)重肝腎功能不全、自身免疫性疾病、風(fēng)濕性疾病、感染性疾病、血液系統(tǒng)疾病、慢性炎癥性疾病及結(jié)核、腫瘤患者。所有研究對(duì)象均為臺(tái)州地區(qū)漢族人，彼此間無血緣關(guān)系，既往無卒中史。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有研究對(duì)象均知情同意。

表1 兩組對(duì)象一般臨床資料比較

1.2 主要試劑和儀器 外周血基因組DNA抽提試劑盒（型號(hào)：S20060081 GK4001-100，上海捷瑞生物工程有限公司）；PCR產(chǎn)物純化試劑盒（型號(hào)：E5200S 100reaction，美國NEB公司）。核酸定量分析儀（型號(hào)：752N，上海精科儀器有限公司）；流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）；ABI 3730XL測(cè)序儀（美國ABI公司）。

1.3 標(biāo)本采集 抽取所有受試者清晨空腹靜脈血4ml，以乙二胺四乙酸二鈉抗凝，用于基因組DNA抽提，保存于-86℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 DNA提取 采用外周血基因組DNA抽提試劑盒從白細(xì)胞中提取基因組DNA，核酸定量分析儀測(cè)定DNA濃度和吸光度（A260/A280）比值，將比值位于1.7～2.0者作為PCR擴(kuò)增模板。

1.4.2 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 選用DNAStar軟件設(shè)計(jì)引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。CD41上游引物：5′-CTCAAGGTAAGAGCTGGGTGGAAGAAAGAC-3′，下游引物：5′-CTCACTACGAGAACTGGATCCTGAAGCCTC-3′；CD61 上游引物：5′-CTGCAGGAGGTAGAGAGTCGCCATAG-3′，下游引物：5′-CTCTCTAGACCTC-CACCTTGTGCTCT-3′。PCR反應(yīng)體系為上下游引物各0.5μl，2×MasterMix 12.5μl，DNA 模板 1μl，加雙蒸水至總體積25μl。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 2min，變性94℃ 45s，退火 56℃ 30s，延伸 72℃ 45s，共 35 個(gè)循環(huán)。吸取擴(kuò)增產(chǎn)物5μl，于瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像分析PCR產(chǎn)物特異性。

1.4.3 序列分析 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物寄往上海桑尼生物科技有限公司，采用ABI 3730XL測(cè)序儀進(jìn)行基因測(cè)序分析。

1.5 CD41、CD61表達(dá)率檢測(cè) 采取的靜脈血標(biāo)本在6h之內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD41、CD61表達(dá)率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用Pearson雙側(cè)χ2檢驗(yàn)評(píng)估Hardy-Weinberg平衡，P＞0.05表示符合Hardy-Weinberg平衡。基因計(jì)數(shù)法計(jì)算兩組基因型和等位基因頻率，等位基因頻率=（2×純合子+雜合子數(shù)）（/2×受檢人數(shù)）。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用 Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。采用多因素logistic回歸分析發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化性急性腦梗死的危險(xiǎn)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 腦梗死組和對(duì)照組CD41基因型分布經(jīng)卡方擬合優(yōu)度檢驗(yàn)均符合Hardy-Weinberg平衡（腦梗死組：χ2=0.460，P=0.794；對(duì)照組：χ2=0.310，P=0.857），表明研究對(duì)象具有群體代表性。CD61基因型均為基因TT型（未突變型）。

2.2 兩組CD41多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布 兩組CD41多態(tài)性基因型和等位基因頻率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。以TT基因型作為參考，分析動(dòng)脈粥樣硬化性急性腦梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果顯示TG+GG基因型與動(dòng)脈粥樣硬化性急性腦梗死發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)（OR=1.719，95%CI：1.059～2.788，P＜0.05）。以T等位基因作為參考，分析動(dòng)脈粥樣硬化性急性腦梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果顯示G等位基因與動(dòng)脈粥樣硬化性急性腦梗死發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)（OR=1.517，95%CI：1.079～2.120，P＜0.05）。

表2 兩組CD41多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布[例（%）]

2.3 兩組CD41和CD61表達(dá)率比較 腦梗死組CD41表達(dá)率為（98.68±1.49）%，高于對(duì)照組的（97.76±5.53）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.950，P=0.028）。腦梗死組CD61表達(dá)率為（98.41±1.88）%，對(duì)照組為（98.28±2.61）%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.156，P=0.694）。

2.4 腦梗死組TG+GG基因型和TT基因型CD41表達(dá)率比較 腦梗死組TG+GG基因型CD41表達(dá)率為（98.22±4.24）%，高于 TT 基因型的（95.41±3.88）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.107，P=0.038）。

2.5 多因素logistic回歸分析發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化性急性腦梗死的危險(xiǎn)因素 將兩組對(duì)象性別、年齡、高血壓史、2型糖尿病史、吸煙史、飲酒史、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、TG、TC、HDL、LDL、同型半胱氨酸、糖化血紅蛋白、ESR、hs-CRP和CD41多態(tài)性基因型等資料納入多因素logistic回歸方程，結(jié)果顯示高血壓史、收縮壓、空腹血糖、同型半胱氨酸、TG+GG基因型是發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化性急性腦梗死的危險(xiǎn)因素（均P＜0.05），見表3。

表3 多因素logistic回歸分析發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化性急性腦梗死的危險(xiǎn)因素

3 討論

血小板膜糖蛋白CD41/CD61是細(xì)胞黏附受體整合素家族成員之一，其與纖維蛋白原、膠原或血管性血友病因子等相結(jié)合可促使血小板黏附、聚集，故在血栓性疾病的形成中起著關(guān)鍵作用[3]。CD41和CD61基因位于17q21-q22。CD41基因全長(zhǎng)約17.2kb，含有30個(gè)外顯子和29個(gè)內(nèi)含子，分子量約154kDa。CD61基因全長(zhǎng)約46.0kb，屬單拷貝基因，含14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子，分子量約95kDa。CD41基因位于CD61基因3′端，兩個(gè)基因相距不足360kb。在未被激活的血小板中，CD41和CD61分開分布于血小板膜表面，在誘導(dǎo)劑作用后，兩者相互作用形成GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物，成為凝血因子的受體，凝血因子結(jié)合在活化的血小板上，在Ca2+參與下實(shí)現(xiàn)聚集反應(yīng)。CD41/CD61這種作用為血小板聚集的最終環(huán)節(jié)[4-5]。

研究表明血小板膜糖蛋白與腦血栓形成密切相關(guān)，其種類很多，較重要的有 CD41、CD42a、CD42b、CD61。CD41與CD61在膜上結(jié)合形成血小板中含量最多、也是最主要的黏附受體，是多種因素引起血小板聚集、血栓形成的最終通道，可直接反映血小板的活化狀態(tài)[6-9]。流式細(xì)胞儀測(cè)定血小板膜糖蛋白的表達(dá)情況成為檢查血小板功能的一種手段。使用流式細(xì)胞儀測(cè)定活化血小板是一種快捷而靈敏的方法，對(duì)血栓性疾病有重要的診斷價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，腦梗死組CD41表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明血小板的活化促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化性急性腦梗死的病理生理過程。研究顯示，隨著血小板活化程度的增強(qiáng)，血栓進(jìn)展速度加快，導(dǎo)致腦梗死病情加重，早期CD41的血清含量升高[6-7]。因此，CD41可作為腦血管病發(fā)生、發(fā)展及病情變化的觀察指標(biāo)。研究表明CD41基因多態(tài)性與腦梗死發(fā)生相關(guān)[8-9]。也有研究表明CD41基因多態(tài)性與年輕人和年輕白人婦女的動(dòng)脈粥樣硬化性急性腦梗死相關(guān)[10-11]。本研究結(jié)果與此一致。臨床上抑制血小板功能的藥物被廣泛應(yīng)用于降低動(dòng)脈粥樣硬化患者發(fā)生動(dòng)脈閉塞的風(fēng)險(xiǎn)。血小板膜糖蛋白CD41/CD61拮抗劑通過抑制血小板膜表面的CD41和CD61與纖維蛋白原、膠原或血管性血友病因子相互作用，從而抑制血小板聚集及血栓形成，這是血小板橋接必不可少的。研究表明CD41/CD61拮抗劑可以改善急性腦梗死患者的臨床結(jié)局和降低缺血性腦卒中腦出血的危險(xiǎn)性[12]。本研究結(jié)果顯示在一般臨床資料如性別、年齡、血脂、hs-CRP、飲酒史等匹配的情況下，腦梗死組和對(duì)照組CD41多態(tài)性基因型和等位基因頻率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而多因素logistic回歸分析表明TG+GG基因型的OR值遠(yuǎn)大于1，表明TG+GG基因型是動(dòng)脈粥樣硬化性急性腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，G等位基因是動(dòng)脈粥樣硬化性急性腦梗死的遺傳易感基因。本研究結(jié)果對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化性急性腦梗死的預(yù)防研究具有重要意義。

當(dāng)然，本研究也存在一些局限性：首先，檢測(cè)到CD61基因型均為TT基因型（未突變型），有待進(jìn)一步探尋新的突變位點(diǎn)；其次，本研究未分析不同基因型對(duì)腦梗死患者的預(yù)后和治療效果的影響。這些問題有待于后續(xù)的研究中進(jìn)一步改進(jìn)、解決。