UCH-L1在彌漫大B細胞淋巴瘤中的表達及預(yù)后相關(guān)因素探討

王金潔 徐如君

彌漫大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤中最常見的一種，約占每年新發(fā)淋巴瘤的25%～30%[1]。DLBCL具有顯著的異質(zhì)性，大約有30%～40%的DLBCL患者治療無效或治療后迅速復(fù)發(fā)，疾病進展快，預(yù)后差[2]。因此，探索新的治療靶點成為了當(dāng)前淋巴瘤研究的熱點。泛素羧基末端水解酶 1（ubiquitin carboxy terminal hydrolase 1，UCH-L1）是去泛素化酶家族成員之一，參與泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑，對維持細胞正常生理功能具有重要的意義。UCH-L1基因表達異常與多種人類腫瘤的發(fā)生有關(guān)，其在淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展中也起著至關(guān)重要的作用。然而，UCH-L1在DLBCL中的表達情況及與患者預(yù)后的相關(guān)性國內(nèi)尚未見相關(guān)報道。原癌基因B細胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）和B細胞淋巴瘤因子6（Bcl-6）屬于抗細胞凋亡家族，在淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，Ki-67是與細胞周期密切相關(guān)的核抗原。本研究從UCH-L1在DLBCL組織樣本中的表達入手，研究其與DLBCL臨床病理特征及預(yù)后相關(guān)因素的關(guān)系，探討其潛在價值，并分析了其與Bcl-2、Bcl-6和Ki-67表達的相關(guān)性。

1 對象和方法

1.1 對象 收集本院2014年1月至2018年1月存檔的石蠟包埋DLBCL組織樣本149例，患者男85例，女64 例；年齡 15～89（62.01±15.03）歲；按照 Hans分型分為生發(fā)中心樣B細胞淋巴瘤（germinal center like-B cell lymphoma，GCB）45例和非生發(fā)中心樣B細胞淋巴瘤（non-germinal center like-B cell lymphoma，Non-GCB）104例。所有患者均由2位病理醫(yī)師參照WHO（2008）造血與淋巴組織腫瘤分類法獨立進行診斷。另取6例反應(yīng)性增生的正常人扁桃體作為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準通過。

1.2 臨床資料收集 收集患者的臨床資料，包括性別、年齡、Hans分型、Ann Arbor分期、乳酸脫氫酶（LDH）水平（參考值50～240U/L）、白蛋白水平、有無B癥狀、有無骨髓侵犯和國際預(yù)后評分指數(shù)（IPI）等相關(guān)資料。

1.3 免疫組化染色 3μm厚切片石蠟包埋標本采用En Vision兩步法，按照試劑盒說明書行免疫組化染色。兔多克隆抗體UCH-L1（克隆號ABP52672）購自中國臺灣Abnova公司，以細胞質(zhì)見棕黃色顆粒為陽性，比較細胞形態(tài)、胞質(zhì)染色強弱及陽性細胞數(shù)。鼠抗人單克隆抗體 Bcl-2（克隆號 ZM-0010）、Bcl-6（克隆號 ZM-0011）和Ki-67（克隆號ZM-0167）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Bcl-2為細胞質(zhì)或胞膜著色，Bcl-6、Ki-67為細胞核著色。Ki-67結(jié)果以計數(shù)1 000個腫瘤細胞中陽性細胞表達百分數(shù)來標注，Ki-67在20%～30%以下為相對惰性的淋巴瘤，30%～80%為侵襲性的淋巴瘤，＞80%為高侵襲性的淋巴瘤[3]，故以80%為分界。其余指標以30%的腫瘤細胞出現(xiàn)定位清晰的棕黃色為陽性表達。采用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman等級相關(guān)分析UCH-L1陽性表達與Bcl-6、Bcl-2、Ki-67表達的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UCH-L1表達情況 對6例反應(yīng)性增生的正常人扁桃體行UCH-L1 HE染色可見兩個濾泡生發(fā)中心，連續(xù)切片免疫組化染色發(fā)現(xiàn)UCH-L1陽性表達于濾泡生發(fā)中心內(nèi)，而在套細胞、邊緣區(qū)淋巴細胞和濾泡間淋巴細胞中呈陰性表達（圖1-2）。在病例樣本中，UCH-L1呈散在片狀或彌漫陽性表達于腫瘤組織中，而在周圍正常組織中未見其表達（圖3）。

圖1 反應(yīng)性增生的正常人扁桃體HE染色情況（×100）

圖2 反應(yīng)性增生的正常人扁桃體UCHL1表達情況（En Vision法，×100）

圖3 1例GCB型DLBCL病例UCH-L1表達情況（En Vision法，×100）

2.2 DLBCL組織中UCH-L1陽性表達與臨床病理特征的關(guān)系 149例DLBCL患者中，36例UCH-L1陽性表達，UCH-L1陽性表達患者發(fā)病年齡15～89（55.08±17.58）歲。DLBCL組織中UCH-L1陽性表達與患者年齡和Hans分型均有關(guān)（均P＜0.05），而與患者性別無關(guān)（P＞0.05），見表 1。

2.3 DLBCL組織中UCH-L1陽性表達與預(yù)后相關(guān)因素的關(guān)系 DLBCL組織中UCH-L1陽性表達與Ann Arbor分期、LDH水平和IPI均有關(guān)（均P＜0.05），而與白蛋白水平、有無B癥狀和有無骨髓侵犯均無關(guān)（均P＞0.05），見表2。

2.4 UCH-L1 陽性表達與 Bcl-6、Bcl-2、Ki-67 表達的相關(guān)性分析 UCH-L1陽性表達與Bcl-6、Bcl-2、Ki-67表達均無相關(guān)性（均P＞0.05），見表3。

表1 DLBCL組織中UCH-L1陽性表達與臨床病理特征的關(guān)系

表2 DLBCL組織中UCH-L1陽性表達與預(yù)后相關(guān)因素的關(guān)系

表3 UCH-L1陽性表達與Bcl-6、Bcl-2、Ki-67表達的相關(guān)性分析

3 討論

UCH-L1是一種去泛素化酶，具有泛素羧基端水解酶的活性，參與泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑，能高效并高度選擇性地進行細胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)換，對維持細胞正常生理功能具有重要意義。UCH-L1最初被發(fā)現(xiàn)特定表達于腦、睪丸和卵巢組織中，其表達失調(diào)與阿爾茨海默病、帕金森綜合征等神經(jīng)退行性疾病和性別發(fā)育異常密切相關(guān)[4]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)UCH-L1基因表達異常與多種人類腫瘤的發(fā)生有關(guān)，但它在不同腫瘤中的功能卻并不一致。在非小細胞肺癌、乳腺癌、腎癌中，UCH-L1是一個癌基因，其高表達與腫瘤侵襲性有關(guān)并往往提示患者預(yù)后不良[5-7]；在鼻咽癌、肝癌中，UCH-L1卻起著抑癌基因的作用，由于啟動子區(qū)高甲基化使其表達缺失，進而促進了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8-9]。在淋巴瘤方面，人們發(fā)現(xiàn)UCH-L1去泛素化酶活性在惡性B細胞生長和生存中是必不可少的，起著關(guān)鍵性作用，UCH-L1過表達明顯增加轉(zhuǎn)基因小鼠淋巴瘤的形成，在Burkitt淋巴瘤和EB病毒感染的B淋巴細胞中普遍存在UCHL1基因高表達[10-13]。盡管國外已有不少研究指出UCHL1在B細胞淋巴瘤發(fā)育進展過程中是一個多功能的癌前因子[10-15]，但在臨床病例樣本中的研究較少，有關(guān)UCH-L1在DLBCL中的表達情況及與預(yù)后因素的關(guān)系國內(nèi)尚未見相關(guān)報道。

DLBCL是B細胞非霍奇金淋巴瘤中最常見的一種亞型，具有高度異質(zhì)性，按Hans分型可分為GCB型和Non-GCB型兩型。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)UCH-L1特異地表達于反應(yīng)性增生的正常人扁桃體的濾泡生發(fā)中心內(nèi)，本研究中GCB型UCH-L1陽性表達率明顯高于Non-GCB型，提示UCH-L1與GCB型DLBCL的發(fā)生高度相關(guān)，且UCH-L1陽性表達者年齡較小，多見于中青年。在與預(yù)后相關(guān)因素分析中發(fā)現(xiàn)UCH-L1表達陽性者往往具有較高的LDH水平、Ann Arbor分期（Ⅲ～Ⅳ期）和IPI（3～5分），這些都提示患者預(yù)后不良。研究指出UCH-L1過表達會影響生發(fā)中心B細胞有關(guān)細胞的周期進展、細胞增殖和凋亡以及DNA修復(fù)信號通路基因的表達，其表達的增加預(yù)示了一種不依賴于Myc表達的DLBCL早期復(fù)發(fā)的可能性[14]，這可部分解釋為何UCH-L1陽性的DLBCL患者預(yù)后較差。

原癌基因Bcl-6屬于抗細胞凋亡家族，編碼核轉(zhuǎn)錄抑制蛋白，在生發(fā)中心B細胞和具有生發(fā)中心B細胞表型的淋巴瘤中高表達。Bcl-2是凋亡抑制基因，能抑制腫瘤細胞凋亡，在淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展以及對放化療的敏感性上起著重要作用[16]。有研究指出在生發(fā)中心B細胞中UCH-L1能與Bcl-6協(xié)同作用，共同促進小鼠淋巴瘤的發(fā)生，UCH-L1高的腫瘤通常具有顯著的形態(tài)學(xué)特點——具有典型或不典型的Burkitt淋巴瘤組織學(xué)結(jié)構(gòu)，免疫組化表現(xiàn)為Bcl-2陰性，Bcl-6陽性[14-15]。Ki-67是與細胞周期密切相關(guān)的核抗原，可作為判斷細胞增殖狀態(tài)和腫瘤惡性程度的指標，Katzenberger等[3]認為Ki-67在套細胞淋巴瘤中是一個獨立的預(yù)后指標。本研究顯示UCH-L1陽性表達與Bcl-6、Bcl-2、Ki-67表達均無相關(guān)性。可能原因為對陽性判斷標準不一，本研究以30%的腫瘤細胞出現(xiàn)定位清晰的棕黃色為陽性，這一標準與其他研究者相比，可能有所不同；也可能是受不同克隆號的單克隆抗體的影響。

綜上所述，UCH-L1陽性表達在生發(fā)中心源性DLBCL患者中更為普遍，且與提示患者預(yù)后不良的指標密切相關(guān)，這可為DLBCL患者臨床分型和預(yù)后分析提供一定的參考意義。淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展本身是一個多基因、多因素、多階段的病理過程，UCH-L1對DLBCL的影響可能涉及腫瘤細胞的周期進展、細胞增殖及凋亡等多方面因素，其具體的作用機制尚需設(shè)計嚴密的細胞及動物實驗進一步闡明。