家兔產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離、鑒定及致病性分析

佘祿明

（松原職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林松原 138001）

兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病是由產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）感染引起的以腹瀉和脫水死亡為特征的一種急性傳染?。ɡ钐熘サ龋?019；史玉穎等，2018）。家兔是產(chǎn)氣莢膜梭菌的易感動物之一，兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病可感染多個品種和年齡段，其中，對幼兔的危害最為嚴(yán)重，該病在幼兔中的發(fā)病率高達(dá)90%以上，死亡率為100%（馬愛華和朱鳳霞，2018；Tao等，2017；Zhao等，2017）。目前，該病已在山東、福建、重慶等20多個省市流行，該病的流行無明顯季節(jié)性，但在冬春多發(fā)（李達(dá)偉，2018；陳錫存，2017）。這可能與氣候、飼料等因素的改變有關(guān)，導(dǎo)致家兔產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，免疫力下降，腸道菌群失衡，促進(jìn)產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速繁殖，腸道中的毒素累積，誘 發(fā) 疫 病（Waleed等，2016；Hamd等，2006）?；疾〖彝贸３霈F(xiàn)精神不振、食欲減退、腹脹、拉膠凍樣褐色稀糞等癥狀，最終脫水死亡（王曉麗等，2015）。

產(chǎn)氣莢膜梭菌為該病病原，又稱魏氏梭菌，是一種兩端頓圓，單個或成對排列，可產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陽性菌，可產(chǎn)生多種毒素，對腸道危害最為嚴(yán)重，常形成壞死性腸炎和腸毒血癥，在自然界中分布廣泛（范國壽，2013；邢蘭君和劉輝，2012；黃生蓮等，2009）。產(chǎn)氣莢膜梭菌種類多樣，主要包括A、B、C、D和E型，其中A型最為常見且對動物危害最，嚴(yán)重，也是引起兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病的主要類型。產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病性主要與α、β、ε和τ、腸毒素和θ毒素等有關(guān)（呂長輝，2013）。目前，該病的防治方法主要為加強飼養(yǎng)管理與疫苗接種，但由于該病發(fā)病迅速，死亡周期短，家兔一旦發(fā)病，多數(shù)已無治療價值（do Carmo等，2018；李偉東，2009）。因此，開展兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病的病原學(xué)研究十分必要，本研究針對家兔腹瀉死亡病例進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及致病性分析，為兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病的防控提供理論依據(jù)，也為產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗候選株的篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑 10%兔鮮血平板由本實驗室提供，TSC選擇鑒別培養(yǎng)基購于北京陸橋有限公司，2×Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA marker、細(xì)菌基因組提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，細(xì)菌通用引物F1/R1由生工生物工程有限公司合成，引物序列為：

F1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，R1：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。

1.2 試驗動物及分組 試驗選取30日齡健康肉兔6只，隨機分為試驗組和對照組，每組3只。

1.3 病原菌的分離純化 取腸道內(nèi)容物劃線接種于10%兔鮮血平板和TSC選擇鑒別培養(yǎng)基中，置于41℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，并對純化的病原菌進(jìn)行革蘭氏染色。

1.4 病原菌的分子鑒定 利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取純化后的病原菌基因組，進(jìn)行PCR鑒定，反應(yīng)體系為：DNA模板2 μL，上下游引物 F1/R1各 0.2 μL，2×Taq PCR Master Mix 25μL，dd H2O 21.6 μL；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 3 min，94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 30s，35個循環(huán)，72℃延伸8 min，反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 將16S rDNA基因序列測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行比對分析，并基于病原菌16S rDNA基因序列，借助MEGA5.0軟件，利用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)的進(jìn)化發(fā)育樹。

1.6 生化鑒定 挑取病原菌單菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)24 h，取適量菌液分別接種于生化鑒定管中，對病原菌的生化特性進(jìn)行鑒定。

1.7 致病性分析 用PBS將菌液濃度調(diào)整為109cfu/mL，試驗組肉兔通過腹腔注射稀釋后的菌液0.2 mL/只，對照組腹腔注射相同用量的PBS，正常飼喂，觀察記錄肉兔發(fā)病情況，同時剖檢死亡肉兔，并進(jìn)行病原菌再分離。

圖1 革蘭氏染色結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 革蘭氏染色結(jié)果 通過對病原菌的分離純化，分離到1株產(chǎn)氣莢膜梭菌疑似菌株，革蘭氏染色后發(fā)現(xiàn)，該菌為單個或成對排列的革蘭氏陽性菌，結(jié)果見圖1。

2.2 PCR鑒定結(jié)果 通過對病原菌16S rDNA基因序列的擴增發(fā)現(xiàn)，在1500 bp的位置出現(xiàn)單一條帶，經(jīng)測序確定其大小為1450 bp，與預(yù)期結(jié)果一致，結(jié)果見圖2。

圖2 PCR鑒定結(jié)果

2.3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹 將病原菌16S rDNA基因序列在NCBI中進(jìn)行Blast比對分析發(fā)現(xiàn)，其與產(chǎn)氣莢膜梭菌的同源性最高（99%）。在系統(tǒng)進(jìn)化樹中分離的病原菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌聚為一簇（NCBI登錄號：Y12669.1），與梭菌屬的破傷風(fēng)梭菌和肉毒梭菌處于不同分支，而與芽孢桿菌屬的凝結(jié)芽孢桿菌距離最遠(yuǎn)，結(jié)果見圖3。

圖3 基于16S?rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹

2.4 生化鑒定 通過對病原菌的生化鑒定發(fā)現(xiàn)，山梨醇、吲哚實驗為陰性，其與檢測項目均為陽性。

表1 病原菌生化鑒定結(jié)果

2.5 致病性分析 通過腹腔注射將分離純化的病原菌攻毒肉兔，分析其致病性，發(fā)現(xiàn)實驗組在攻毒8 h后開始出現(xiàn)精神萎靡、四肢無力等癥狀，12 h開始出現(xiàn)死亡，并伴隨腹瀉癥狀，16 h后試驗組肉兔全部死亡，而對照組肉兔均正常。剖檢死亡肉兔發(fā)現(xiàn)，腸道出現(xiàn)彌漫性出血點，腸道內(nèi)有脹氣，內(nèi)容物呈水樣，腸黏膜有脫落現(xiàn)象，癥狀見圖4，對病原菌微生物進(jìn)行再分離純化，發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)容物中有大量病原菌，經(jīng)分子鑒定，確定與攻毒菌株為同一株菌。

圖4 腸道病變

3 討論分析

產(chǎn)氣莢膜梭菌分布廣泛，可存在土壤、飼料、飲水和糞便中，也可存在于人或動物的體內(nèi)，人和動物一旦感染極易發(fā)病。兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病主要呈地區(qū)性流行或散發(fā)性發(fā)生，本病的流行無明顯的季節(jié)性，但在冬春兩季發(fā)病率較高。在飼養(yǎng)管理不當(dāng)、飼料變更、氣溫變化、長途運輸?shù)榷喾N因素影響下，兔抵抗力下降，各種條件致病菌易誘發(fā)疫病，導(dǎo)致腸道菌群失衡，若此時家兔腸道中存在產(chǎn)氣莢膜梭菌，會在短時間內(nèi)快速繁殖，分泌外毒素，引起家兔腹瀉，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡。本病的主要臨床癥狀為急性水樣腹瀉，發(fā)病初期糞便呈黑褐色，逐漸發(fā)展為黑褐色水樣或膠凍狀，后期發(fā)展為四肢癱軟，嚴(yán)重脫水，最終死亡。家兔感染后多在當(dāng)日或次日發(fā)病死亡，少數(shù)周期較長，可達(dá)1周左右。呂長輝等（2013）利用劃線接種法進(jìn)行兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病例的病原菌分離時發(fā)現(xiàn)，肝臟病料中的產(chǎn)氣莢膜梭菌分離率較低，而通過肉湯培養(yǎng)的方法可從多數(shù)病料中分到產(chǎn)氣莢膜梭菌，提出產(chǎn)氣莢膜梭菌大多不是單純的腸毒血癥致病致死，腸道中的產(chǎn)氣莢膜梭菌可以突破腸黏膜屏障形成菌血癥。雖然上述方法可以有效分離肝臟中的產(chǎn)氣莢膜梭菌，但直接進(jìn)行肉湯培養(yǎng)時會導(dǎo)致較多雜菌的繁殖，影響目標(biāo)菌株的分離效果，因此，本研究以患病家兔腸道內(nèi)容物為病料進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離純化，成功分離到1株目標(biāo)菌株。通過生化鑒定發(fā)現(xiàn)，病原菌的吲哚實驗為陰性，與寇敘等（2014）等的研究相反，存在差異性。通過對分離到的產(chǎn)氣莢膜梭菌致病性分析發(fā)現(xiàn)，家兔在攻毒8 h后出現(xiàn)精神萎靡、四肢無力等癥狀，16 h后全部死亡，而對照組肉兔均正常，表明所得菌株具有較強的毒性。楊軍等（2014）雖然對兔源魏氏梭菌的毒性進(jìn)行分析，但僅以小鼠為動物模型，未研究出病原菌對本體動物的致病性。本研究對家兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病進(jìn)行了系統(tǒng)的病原分析與鑒定，明確了該兔場存在產(chǎn)氣莢膜梭菌，具有兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病感染的風(fēng)險，為兔場疫病防控指明了方向。

4 結(jié)論

對兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病疑似病例中病原菌的分離鑒定，成功獲得1株兔源產(chǎn)氣莢膜梭菌，具有較強的致病性，為產(chǎn)氣莢膜梭菌致病機制的研究奠定了基礎(chǔ)，同時也為疫病診斷和防控提供理論依據(jù)。