微波處理條件對蛋清結構和IgG結合能力的影響

陳紅兵 楊 皞 高金燕 佟 平

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室， 南昌 330047； 2.南昌大學中德聯(lián)合研究院， 南昌 330047；3.南昌大學食品學院， 南昌 330031)

0 引言

雞蛋是眾多食品的原材料來源之一，同時它也被認定為第二大食物過敏原[1]。雞蛋過敏是兒童早期常見的食物過敏形式之一，它會引起皮膚病變、腹痛和腹瀉等癥狀，甚至可能會引起患者死亡。已有研究表明，造成雞蛋過敏的主要過敏原有卵類粘蛋白、卵白蛋白、卵轉鐵蛋白和溶菌酶[2-3]。雞蛋過敏嚴重影響著特殊人群的身體健康，已經(jīng)成為人類公共營養(yǎng)和食品安全問題。

目前，超聲波、水浴加熱和恒溫箱加熱等加工處理方式已被廣泛應用于降低蛋清致敏性，而微波處理對蛋清致敏性影響的研究則相對較少。微波是一種波長在1～1 000 mm之間的電磁波，介于紅外線和無線電波之間[4]。微波輻射在眾多工業(yè)和商業(yè)領域已經(jīng)應用60多年[5-6]。相比其他加工處理方式，微波具有快速高效、節(jié)能環(huán)保、操作簡便等優(yōu)點[7-9]，另外，微波的能量消耗較少，也被廣泛應用于食品工業(yè)中干燥、加熱和殺菌等環(huán)節(jié)[10]。除此之外，在蛋白質(zhì)加工方面，微波也可應用于輔助水解、萃取和改性等[11-13]。

近年來，利用微波處理技術控制食物的致敏性已開展了一些研究，文獻[14]利用微波處理蝦過敏蛋白，結果表明加工后的過敏蛋白致敏性降低。文獻[15]采用微波處理擬穴青蟹蟹肉，分析原肌球蛋白(TM)的消化穩(wěn)定性及過敏原性，結果顯示，與未經(jīng)處理的樣品相比，微波處理后的TM消化穩(wěn)定性及過敏原性沒有明顯變化。文獻[16]研究發(fā)現(xiàn)，微波輔助木瓜蛋白酶水解乳清蛋白，有助于提高乳清蛋白的水解度和降低乳清蛋白中β-乳球蛋白的致敏性。文獻[17]研究表明，微波處理可降低其抗原性，且抗原性的改變與蛋白結構的展開和蛋白的變性有關。綜上，微波處理可改變食物過敏蛋白的致敏性。然而，目前關于微波處理對蛋清致敏性和結構的影響的研究相對較少。因此，開展微波處理蛋清研究對于改變蛋清致敏性和結構具有實際意義。

蛋白質(zhì)的氨基酸組成和序列、空間結構、凈電荷及其分布、表面疏水性等均會影響蛋白質(zhì)功能性質(zhì)。本文采用微波加工技術，通過控制功率和時間，利用SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳)、圓二色光譜分析、內(nèi)源性熒光光譜分析、外源性熒光光譜法等方法對經(jīng)微波處理前后的蛋清樣品進行結構表征。同時，采用間接ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)法對其IgG(免疫球蛋白G)結合能力進行分析，從而探究微波處理條件對蛋清蛋白結構和致敏性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白殼雞蛋購于南昌市青山湖區(qū)天虹商場?？捡R斯亮藍G250、牛血清白蛋白(BSA)標準品、十二烷基磺酸鈉(SDS)、0.4 g/mL丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺(體積比29∶1)、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(AP)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、β-巰基乙醇，生工生物工程(上海)股份有限公司；預染蛋白marker，德國Fermentas公司；考馬斯亮藍R250，上海化學試劑公司分裝廠；溴酚藍，上海化學試劑總廠試劑二廠。

1.2 儀器與設備

Lambda25型紫外可見分光光度計，美國PerkinElmer公司；J-810型圓二色光譜儀，日本分光公司；F-4600型熒光分光光度計，日本日立公司；Mode1860型酶標儀，美國Bio-Rad公司；Milli-Q型超純水系統(tǒng)，美國密理博公司；高速冷凍離心機，美國ThermoScientific公司；迷你型蛋白垂直電泳儀，美國Bio-Rad公司；PB-10型pH計，德國賽多利斯公司；HJ-A6型恒溫磁力攪拌水浴鍋，常州萬順儀器制造有限公司。

1.3 分析方法

1.3.1蛋清的分離和微波處理

手工分離鮮雞蛋蛋清，高速分散機4 200 r/min攪拌55 min，再8 000 r/min離心30 min，取上清于4℃?zhèn)溆?。隨后分別采用0、80、240、400、640 W的微波功率，對樣本進行0、10、20、30、40 s的處理后于4℃保存。

1.3.2蛋清蛋白質(zhì)量濃度的測定

參照Bradford法測定雞蛋中蛋清主要蛋白質(zhì)量濃度。使用不同質(zhì)量濃度的BSA作為標準溶液，繪制蛋白質(zhì)量濃度的標準曲線，通過標準曲線得出樣品的質(zhì)量濃度。

1.3.3SDS-PAGE分析

制備10%的分離膠和4%的濃縮膠，將蛋白樣品與上樣緩沖液按料液比1 g/mL混合后煮沸加熱5 min，然后1 000 r/min離心3 min。樣品上樣量為10 μL。電泳條件濃縮膠：12 mA，30 min；分離膠：24 mA，90 min。電泳完畢后，首先采用考馬斯亮藍G250對膠染色15 min，然后脫色至有清晰條帶出現(xiàn)。拍攝蛋白膠觀察蛋清體系中蛋白質(zhì)分子量的變化。

1.3.4蛋清蛋白與IgG結合能力檢測

將不同微波處理下(微波功率80、240、400、640 W，處理時間10、20、30、40 s)后的樣品以1.25 μg/mL的質(zhì)量濃度包被于96孔酶標板中，空白組為PBS(磷酸鹽緩沖液)；陽性對照組為未處理的蛋清蛋白。1∶20 000稀釋的抗蛋清兔血清池作為第一抗體，1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG作為第二抗體。鄰苯二胺(OPD)作為顯色劑。反應結束后在490 nm處測量其光密度(OD值)。根據(jù)不同微波條件處理下OD值的大小判定蛋清蛋白的IgG結合能力強弱。

1.3.5圓二色光譜分析

采用圓二色光譜分析不同微波條件處理前后蛋清蛋白二級結構變化。蛋清蛋白質(zhì)量濃度0.5 mg/mL，條件設定：遠紫外波長掃描范圍190～240 nm，掃描速度100 nm/min，光徑0.1 cm，間隔0.1 nm，帶寬0.1 nm。平行測3次。結果以平均摩爾橢圓率表示，單位為(°)·cm2/dmol。

1.3.6紫外光譜分析

采用紫外可見分光光度計檢測微波處理前后蛋清蛋白結構展開情況。蛋清蛋白質(zhì)量濃度0.1 mg/mL，條件設定：波長掃描范圍250～350 nm，波長間隔1.0 nm，掃描速度中等，帶寬2.0 nm，響應時間0.2 s。

1.3.7內(nèi)源性熒光光譜分析

采用內(nèi)源性熒光光譜分析微波處理蛋清蛋白質(zhì)構象的變化。蛋清蛋白質(zhì)量濃度0.1 mg/mL，條件設定：激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長300～400 nm，應答時間4 s，狹縫寬度5.0 nm，電壓400 V。

圖2 不同微波處理條件下蛋清蛋白質(zhì)的SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE patterns of egg white proteins under different microwave treatment conditions

1.3.8外源性熒光光譜分析

采用外源性熒光光譜分析微波處理蛋清蛋白質(zhì)表面疏水性的變化。取5 mL質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的蛋清樣品，加入30 μL 5 mmol/L的ANS(8-苯胺-1-萘磺酸)溶液，混勻(20℃)下避光反應1 h后進行熒光色譜分析。條件設定：激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長400～700 nm，掃描速度1 200 nm/min，光徑1.0 cm，狹縫寬度5.0 nm，電壓700 V。

1.3.9統(tǒng)計分析

采用Origin 8.0對數(shù)據(jù)進行處理，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行one-way ANOVA分析，當p<0.05時，差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 蛋清蛋白質(zhì)量濃度的確定

圖1 Bradford 法測定蛋白質(zhì)量濃度的標準曲線Fig.1 Standard determination curve of protein mass concentration by using Bradford method

2.2 SDS-PAGE分析

圖2中的泳道M代表預染蛋白Marker。泳道1～17分別表示：1，未處理蛋清；2～5，80 W/10 s、80 W/20 s、80 W/30 s、80 W/40 s；6～9，240 W/10 s、240 W/20 s、240 W/30 s、240 W/40 s；10～13，400 W/10 s、400 W/20 s、400 W/30 s、400 W/40 s；14～17，640 W/10 s、640 W/20 s、640 W/30 s、640 W/40 s等微波處理條件下蛋清蛋白。利用SDS-PAGE對經(jīng)微波處理的蛋清樣品分子量進行分析。圖2顯示，與未經(jīng)微波處理的蛋清樣品(泳道1)相比，經(jīng)微波處理后的蛋清樣品條帶均變淺。這表明蛋清蛋白質(zhì)的濃度發(fā)生了不同程度的降低。其中，經(jīng)80 W/10 s(泳道2)和80 W/20 s(泳道3)處理的樣品后與其他微波條件處理下的蛋清樣品相比蛋清蛋白條帶顏色更淺，這可能與短時間的微波處理使得蛋清蛋白快速變性沉淀導致濃度下降有關。經(jīng)640 W/40 s(泳道17)處理后的蛋清樣品條帶最淺，這與長時間的大功率微波處理導致大部分蛋清蛋白變性有關。該結果與文獻[18]的研究結果接近。

2.3 圓二色光譜分析

利用圓二色光譜檢測經(jīng)微波處理前后蛋清樣品二級結構的變化，圓二色光譜(Circular dichroism，CD)是研究偏振光對不對稱分子作用的一種技術[19]，當分子對左、右圓偏振光的吸收不同時就可以觀察到圓二色光譜，其中蛋白質(zhì)的250 nm以下的圓二色光譜是由肽鍵中氨基生色團決定的[20]，在190～240 nm的波長范圍內(nèi)，圓二色光譜可靈敏地檢測出蛋白質(zhì)二級結構的變化情況，結果如圖3所示。從圓二色光譜圖可知，與未處理的蛋清相比，經(jīng)相同微波功率處理，摩爾橢圓率為零時的波長減小，正峰峰值降低，負峰峰值增大，表明微波使蛋清蛋白的二級結構發(fā)生了改變。

圖3 不同微波功率處理下的蛋清蛋白圓二色譜圖Fig.3 Circular dichroisms of egg white protein under different microwave powers

從圖3a可知，所有蛋清樣品在190 nm附近均有一個正峰，208 nm和222 nm處均有負峰，表明未經(jīng)微波處理的蛋清樣品和微波處理10、20、30 s的樣品均具有典型的α-螺旋結構；微波處理40 s的蛋清樣品在190～200 nm處有一個正峰，216 nm處有一個較強的負峰，表明該蛋清樣品具有典型的β-折疊結構。綜上，當微波功率為80 W時，處理時間越長對蛋白的二級結構影響越大。

從圖3b中可明顯看出，處理時間不同的蛋清樣品均具有典型的α-螺旋結構，雖與未處理蛋清相比變化程度不同，但不同處理時間對蛋清蛋白二級結構的影響并不明顯。

圖3c顯示，處理時間不同的蛋清樣品的譜圖近似重合，表明在微波功率為400 W時，蛋清樣品中α-螺旋結構和β-折疊結構含量與微波處理時間無明顯關系。

當微波處理功率為640 W時(圖3d)，處理10 s的蛋清樣品圖譜變化最大，此時對二級結構的影響最大，隨著時間延長，圖譜又慢慢向未處理蛋清樣品方向偏移，40 s時其樣品中已不含有可以發(fā)生偏振的結構。

2.4 紫外光譜分析

蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜，主要是由于蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸(色氨酸和酪氨酸)殘基側鏈對紫外光的吸收而產(chǎn)生的[21]。因此，可以根據(jù)蛋白質(zhì)對紫外光譜吸收的變化來推斷溶液中蛋白質(zhì)三級結構的改變，具體變化見圖4。

圖4 不同微波功率處理的蛋清蛋白紫外光譜圖Fig.4 UV chromatograms of egg white protein under different microwave powers

在微波處理功率為80 W和240 W(圖4a、4b)時，樣本的紫外吸收光譜降低，且隨著時間延長，吸光度逐漸升高。這表明當處理時間為10 s時，蛋白分子聚集，芳香族氨基酸被掩埋，紫外吸光度降低；但隨著時間的延長，蛋白受熱后其空間結構打開，芳香族氨基酸暴露，吸光度升高。

從圖4c、4d可以看出，微波處理功率為400 W和640 W時，除處理時間為30 s的樣本外，其余樣本隨時間的延長紫外吸光度均逐漸降低，即在這兩種微波功率下，處理時間越長，蛋白分子聚集的程度可能越大。經(jīng)400 W/30 s、400 W/40 s和640 W處理的蛋清樣品其特征吸收峰均發(fā)生了較小程度的紅移，表明溶液中酪氨酸和色氨酸殘基附近的微環(huán)境已經(jīng)發(fā)生了改變。

2.5 內(nèi)源性熒光光譜分析

蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光主要是由色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)以及苯丙氨酸(Phe)發(fā)射產(chǎn)生的，主要以色氨酸為基準來研究蛋白質(zhì)三級結構的改變[22]。

圖5 不同微波功率處理的蛋清蛋白內(nèi)源性熒光光譜圖Fig.5 Endogenous fluorescence spectra of egg white proteins under different microwave powers

圖5a顯示，與未處理的蛋清樣品相比，經(jīng)過微波處理的蛋清樣品熒光強度明顯降低，其中處理時間40 s的樣品熒光強度降低最明顯。所有樣本最大吸收波長λmax并沒有發(fā)生明顯的變化，這可能是由于蛋白質(zhì)發(fā)生了折疊，部分生色基團被破壞或者掩埋。

當微波功率為240 W和400 W(圖5b、5c)時，相比于未處理的蛋清樣品，經(jīng)微波處理30 s和40 s的樣品的熒光強度稍有升高，而處理10 s和20 s的樣品的熒光強度均降低，但相較于80 W條件下的蛋清樣品，其熒光強度均增大。不同微波處理時間下蛋清樣品的最大吸收波長λmax并沒有發(fā)生明顯的變化，其中一種可能是在240 W和400 W的條件下，隨著時間的延長，蛋白質(zhì)分子伸展，暴露了部分生色基團；另一種可能是蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生了交聯(lián)，其表面形成了新的生色基團而導致熒光強度的增加。

圖6 不同微波功率處理的蛋清蛋白外源性熒光光譜圖Fig.6 Exogenous fluorescence spectra of egg white protein under different microwave powers

從圖5d可以明顯看出，相對于未處理的蛋清樣品，經(jīng)微波處理30 s的樣品的熒光強度顯著增大，而處理10、20、40 s的蛋清樣品熒光強度均降低，但處理時間為10 s和20 s的樣品熒光強度均較400 W的大，微波處理時間不同時蛋清樣品的最大吸收波長λmax沒有發(fā)生明顯的變化，這可能是因為隨著微波處理時間的延長，蛋白質(zhì)分子先展開，暴露出部分生色基團導致熒光強度增大，而后蛋白質(zhì)分子發(fā)生折疊，掩埋部分生色基團致使其熒光強度減??；高功率處理蛋清蛋白使得蛋白質(zhì)分子一開始就發(fā)生了交聯(lián)，其表面形成了新的生色基團，熒光強度增大，隨著時間的延長蛋白質(zhì)分子交聯(lián)程度增大，其表面雖有可能形成新的生色基團，但形成的新的生色基團遠少于一開始被包埋基團，所以總體生色基團的量仍減少，致使熒光強度減小。

2.6 外源性熒光光譜分析

由于ANS探針與蛋白質(zhì)結合顯示的熒光強度和蛋白的表面疏水性呈正相關，因此，外源性熒光光譜常用于表征蛋白質(zhì)分子表面疏水性的變化。

如圖6a和圖6b所示，與未經(jīng)微波處理的樣品相比，隨微波處理時間延長樣品的熒光強度先降低后升高，這可能是因為較短時間的處理，蛋白分子發(fā)生折疊，其疏水基被掩埋，隨著處理時間的延長蛋白質(zhì)被打開，疏水基團逐漸暴露，致使其表面疏水性先減小后又增加。

如圖6c和圖6d所示，與未經(jīng)微波處理的蛋清樣品相比，微波處理后樣品的熒光強度均增加，且隨著時間的延長先升高后又降低。微波處理時間為30 s時，蛋清樣品的熒光強度最大。以上可能是由于聚集使蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，從而使蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團被暴露，當處理時間為40 s時，蛋白質(zhì)進一步聚集，暴露在外的內(nèi)部疏水基團又被掩埋。

2.7 微波處理對蛋清蛋白IgG結合能力的影響

如圖7(圖中不同字母表示差異性顯著)所示，與未經(jīng)微波處理的蛋清樣品相比，經(jīng)微波處理后樣品的OD值均有一定程度的降低，表明與IgG結合能力下降，微波處理會在一定程度上降低蛋清蛋白的抗原性。統(tǒng)計分析顯示，微波處理條件為400 W/30 s的蛋清樣品與未處理樣品其IgG結合能力存在顯著性差異(p<0.05)，表明在該處理條件對蛋白抗原性影響最大，此時抗原性最低。當微波處理功率為640 W時，蛋清樣品的抗原性隨微波處理時間的增加逐漸降低；而在400 W時，其樣品的抗原性整體隨處理時間的延長并沒有發(fā)生明顯變化，但處理時間為30 s時其IgG結合能力顯著低于其他條件處理條件下的樣品(p<0.05)。

圖7 蛋清樣品IgG結合能力的評估和不同組別之間的顯著性差異(p<0.05)Fig.7 Evaluation of IgG binding capacity of egg white samples under different microwave treatment conditions and significant differences (p<0.05) between means

結合上述結構的變化分析，蛋清樣品經(jīng)低功率微波處理可能使蛋白質(zhì)分子發(fā)生折疊，形成的二硫鍵隱藏了部分IgG的結合表位，導致其抗原性降低，隨著處理時間的延長，蛋白質(zhì)分子伸展，暴露出部分表位，但暴露的表位遠少于被隱藏的表位，所以其抗原性仍呈降低趨勢。經(jīng)較大功率微波處理且延長處理時間，蛋白質(zhì)分子可能發(fā)生了分子內(nèi)或分子間的聚合從而導致部分IgG的結合表位被隱藏或破壞，導致其抗原性降低。

3 結束語

通過SDS-PAGE分析、圓二色光譜分析、內(nèi)源性熒光光譜分析、外源熒光光譜分析、間接ELISA等方法對不同條件下微波處理后的蛋清蛋白的抗原性和結構進行表征。結果發(fā)現(xiàn)，不同條件的微波處理會不同程度地影響蛋清蛋白的結構，80 W的微波功率下，蛋白質(zhì)的結構先折疊，該條件下處理30 s后，蛋白結構又展開；當微波功率達到640 W時，處理時間較長的蛋白分子產(chǎn)生堆疊。研究還發(fā)現(xiàn)，當功率為400 W、處理時間為30 s時，其抗原性最低，其他微波處理也可以降低蛋清蛋白的抗原性，微波處理通過改變蛋清蛋白的結構進而改變其抗原性。