酸雨對(duì)Cd脅迫下大麥種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

(1.晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 山西 晉中 030619； 2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 太原 030006)

植物生命歷程的起點(diǎn)開始于種子萌發(fā)，萌發(fā)時(shí)的各種參數(shù)及生理特點(diǎn)直接影響植物后期生長(zhǎng)發(fā)育狀況，最終影響作物產(chǎn)量。自1960年開始，我國(guó)污灌的耕地逐漸擴(kuò)大[1]，而重金屬鎘(Cadmium，Cd)經(jīng)污灌排放到作物生態(tài)系統(tǒng)，最終在土壤中大量蓄積造成Cd污染[2-3]。大量研究表明，進(jìn)入農(nóng)田的Cd可以毒害植物，抑制其生長(zhǎng)發(fā)育，影響代謝水平，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植物枯萎死亡，還可通過食物鏈影響人體健康[4-5]，在土壤被重金屬污染的同時(shí)，另一個(gè)環(huán)境污染物酸雨(acid rain，AR)也在威脅著植物的生長(zhǎng)。據(jù)報(bào)道，2015年我國(guó)酸雨污染的土壤約為72.9萬km2，不同pH值的酸雨會(huì)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，在自然界，各種污染物經(jīng)常以復(fù)合污染的形式出現(xiàn)[6-8]。

大麥(Hordeumvulgare)，營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，種植廣泛，是開發(fā)保健食品的作物來源，也是制造啤酒的重要原材料[9]。大麥還容易培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度快、對(duì)環(huán)境脅迫因子較為敏感，是研究環(huán)境脅迫因子對(duì)作物影響的理想實(shí)驗(yàn)材料。目前，Cd與酸雨復(fù)合污染方面的研究主要集中在玉米[3]、紫萼玉簪[10]、大豆[11]和油菜[12]等幾種植物上，而二者復(fù)合污染對(duì)大麥幼苗種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)影響的研究還未見報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)采用室內(nèi)培養(yǎng)法，以大麥為試驗(yàn)材料，研究了外源Cd和模擬酸雨脅迫下大麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的響應(yīng)，旨在揭示Cd和酸雨對(duì)大麥種子和幼苗生長(zhǎng)的脅迫效應(yīng)規(guī)律，探明大麥對(duì)Cd和酸雨脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)特性，為污染地區(qū)大麥的栽培管理提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為大麥種子(晉科571)，購(gòu)于山西省農(nóng)科院品種資源所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

酸雨配制參照周青等[13]的方法,設(shè)置pH值分別為4.0、5.0兩個(gè)強(qiáng)度，記作pH 4、pH 5，并經(jīng)PHS-25型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)校準(zhǔn)；Cd處理設(shè)置為5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-13個(gè)濃度(以純Cd2+計(jì))，記作Cd 5、Cd 10、Cd 20；Cd和酸雨復(fù)合處理組分別記作：Cd 5+pH 5、Cd 10+pH 5、Cd 20+pH 5、Cd 5+pH 4、Cd 10+pH 4、Cd 20+pH 4；以不加氯化鎘且pH=7.0為對(duì)照(ck)。共設(shè)10個(gè)處理組，每處理組3個(gè)重復(fù)。

1.2.2材料培養(yǎng)

挑選籽粒飽滿、堅(jiān)實(shí)、大小基本一致的大麥種子，5% NaClO消毒30 min后，去離子水洗凈，整齊放入鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，在每一培養(yǎng)皿中放40粒大麥種子，將各處理組培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中浸種萌發(fā)，條件控制為：白天25 ℃，黑夜20 ℃，自然光照，每天更換處理液1次，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)。

表1 酸雨對(duì)Cd脅迫下大麥種子萌發(fā)指標(biāo)的影響

處理組/(mg·L-1)發(fā)芽率/%發(fā)芽勢(shì)/%發(fā)芽指數(shù)活力指數(shù)異狀發(fā)芽率/%ck97.50±3.1896.12±2.6529.27±1.525.06±0.360.00±0.00Cd598.33±2.54b97.46±1.92a*29.91±1.39a5.13±0.55a0.00±0.00aCd1096.67±2.16b94.28±2.54b*28.18±1.43b*4.89±0.48a0.00±0.00aCd2090.83±3.02b**85.27±3.09b**27.94±1.38a*4.59±0.61a*2.50±0.27a**Cd5+pH599.17±3.22a*97.65±2.81a*30.23±2.06a5.21±0.82a*0.00±0.00aCd10+pH597.50±2.17a95.26±1.69a*29.13±1.74a4.98±0.68a0.00±0.00aCd20+pH591.67±2.46a**92.11±2.86a**28.04±1.73a*4.66±0.81a*2.50±0.63a**Cd5+pH495.00±2.87c*94.91±3.28b*29.36±2.18b5.01±0.76b0.00±0.00aCd10+pH493.33±2.75c**90.51±2.67c**29.11±1.49ac4.76±0.45b*0.00±0.00aCd20+pH484.17±2.71c**81.24±2.65c**27.53±1.84a*4.56±0.59b**5.00±0.39b**

注：同列與ck相比，“*”表示差異顯著(p<0.05)，“**”表示差異極顯著(p<0.01)；同列相同Cd濃度不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。下同。

1.2.3測(cè)定方法

脅迫7 d時(shí)，按照周青等[13]的方法測(cè)定大麥種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、異狀發(fā)芽率等種子發(fā)芽指標(biāo)；幼苗的根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)、生物量、根系耐性指數(shù)的測(cè)定參照肖志華等[14]的方法；α-淀粉酶活性測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)測(cè)定還原糖方法[15]；呼吸速率測(cè)定采用呼吸比重法[15]進(jìn)行。每處理組的3個(gè)重復(fù)測(cè)量結(jié)果取平均值。

1.2.4統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，差異顯著性采用Duncan檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸雨對(duì)Cd脅迫下大麥種子萌發(fā)指標(biāo)的影響

種子品質(zhì)越好，發(fā)芽率越高，出苗數(shù)就越多。而發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)能夠反映種子活力的強(qiáng)弱，活力強(qiáng)，出苗整齊一致，越容易增產(chǎn)[6]。由表1可知，在單一重金屬Cd脅迫下，大麥種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的變化表現(xiàn)為：在處理濃度(0～20 mg·L-1)范圍內(nèi)，低濃度(≤5 mg·L-1)促進(jìn)，5 mg·L-1時(shí)達(dá)最大值，4項(xiàng)指標(biāo)分別比ck增加0.85%、1.39%、2.19%、1.38%；高濃度(≥10 mg·L-1)抑制，20 mg·L-1達(dá)最小值，4項(xiàng)指標(biāo)分別比ck降低了7.63%、11.29%、4.54%、9.29%，且與ck差異達(dá)顯著水平(p<0.05)，表現(xiàn)出低濃度Cd對(duì)大麥種子萌發(fā)有促進(jìn)作用高濃度有抑制作用。隨著酸雨的加入，在低濃度Cd與弱酸雨的復(fù)合處理組(Cd 5+pH 5)大麥種子前4項(xiàng)萌發(fā)指標(biāo)都高于ck，且比相應(yīng)的單一Cd處理組有所增加，說明弱酸雨的加入進(jìn)一步促進(jìn)了種子的萌發(fā)。其余2個(gè)處理組(Cd 10+pH 5、Cd 20+pH 5)4項(xiàng)萌發(fā)指標(biāo)也都高于相應(yīng)的單一Cd處理組，說明弱酸雨的加入對(duì)高濃度Cd處理下大麥種子萌發(fā)的傷害起到了一定的緩解作用。但隨著酸性強(qiáng)度的增加，復(fù)合處理組(Cd+pH 4)4項(xiàng)萌發(fā)指標(biāo)都低于對(duì)照，且都低于pH=5.0相同Cd濃度的處理組，二者表現(xiàn)出對(duì)大麥的協(xié)同傷害作用。

種子異狀發(fā)芽表示只長(zhǎng)出胚芽而胚根生長(zhǎng)異常的種子，可反映逆境對(duì)種子萌發(fā)的傷害[13]。表1顯示，大麥種子只有在高濃度(20 mg·L-1)Cd的單一脅迫和復(fù)合處理下才出現(xiàn)異狀發(fā)芽，且酸性越強(qiáng)的處理組(Cd 20+pH 4)異狀發(fā)芽率越高。綜上說明弱酸(pH=5.0)對(duì)Cd脅迫下大麥種子萌發(fā)有一定的緩解作用，而酸性較強(qiáng)(pH=4.0)時(shí)則對(duì)Cd脅迫下大麥種子萌發(fā)表現(xiàn)為協(xié)同抑制作用。

2.2 酸雨對(duì)Cd脅迫下大麥幼苗生長(zhǎng)的影響

表2表明，單一Cd脅迫對(duì)大麥幼苗的根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)以及生物量產(chǎn)生了明顯的抑制作用，3個(gè)指標(biāo)隨Cd處理濃度增加而逐漸下降，在最高濃度(20 mg·L-1)時(shí)，3個(gè)指標(biāo)較ck分別下降了22.64%、21.68%、15.94%。在復(fù)合處理組中，隨著酸雨的加入，大麥幼苗的根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)以及生物量受到進(jìn)一步的抑制，均低于相應(yīng)的Cd單一處理組，且酸性越強(qiáng)和Cd處理濃度越大的復(fù)合處理組(Cd 20+pH 4)對(duì)3個(gè)指標(biāo)抑制程度越大。表明重金屬Cd和酸雨對(duì)大麥幼苗生長(zhǎng)的傷害起到了協(xié)同抑制作用。

根系耐性指數(shù)是反映植物體耐逆境能力的一個(gè)指標(biāo)[14]。從表2可以看出，在Cd處理濃度范圍內(nèi)，大麥幼苗根系耐性指數(shù)均低于ck，說明根系生長(zhǎng)受到了重金屬Cd的抑制。在復(fù)合處理組(Cd+pH 5和Cd+pH 4)，根系耐性指數(shù)隨Cd處理濃度升高和酸性增強(qiáng)呈下降趨勢(shì)，且都低于相應(yīng)的Cd單一處理組，說明酸雨的加入，加重了對(duì)幼苗根系的傷害，阻礙了根系生長(zhǎng)，使幼苗根系受到明顯抑制。

表2 酸雨對(duì)Cd脅迫下大麥幼苗生長(zhǎng)、α-淀粉酶活性和呼吸速率的影響

處理組/(mg·L-1)根長(zhǎng)/cm苗長(zhǎng)/cm生物量/mg根系耐性指數(shù)α-淀粉酶活性/[mg·(g·h)-1]呼吸速率/[mg·(g·h)-1]ck10.07±0.3212.41±0.75116.24±4.621.00±0.0026.73±1.36563.19±15.31Cd59.96±0.29a*11.96±0.69a115.43±4.37a0.99±0.04a28.45±1.25a**564.24±14.27aCd108.87±0.21a*11.64±0.62a*110.79±5.13a*0.88±0.02a*25.67±1.29a*518.92±17.44b**Cd207.79±0.18a**9.72±0.53a**97.71±3.52a**0.77±0.03a**23.19±1.09b**492.36±15.29b**Cd5+pH59.19±0.25b*11.36±0.79a*115.12±3.29a0.91±0.02b28.72±1.32a**564.44±16.17aCd10+pH58.41±0.17b**11.16±0.64a*108.26±3.64b*0.84±0.03b*25.91±1.34a*521.17±17.92a**Cd20+pH57.53±0.21b**9.35±0.49a**96.34±2.98a**0.75±0.02a**24.71±1.22a*495.12±16.68a**Cd5+pH49.02±0.31b*10.96±0.65a*112.29±3.45b*0.90±0.05b*26.68±1.26b549.71±18.21b**Cd10+pH48.17±0.26c**9.68±0.57b**107.68±3.07b*0.81±0.03c**25.28±1.31ab*466.82±14.64c**Cd20+pH46.29±0.14c**8.87±0.61b**92.76±2.85b**0.62±0.01b**21.06±1.19c**451.87±13.43c**

2.3 酸雨對(duì)Cd脅迫下大麥萌發(fā)種子α-淀粉酶活性的影響

從表2可見，大麥種子萌發(fā)時(shí)α-淀粉酶活性隨Cd處理濃度增加表現(xiàn)為低濃度(5 mg·L-1)促進(jìn)高濃度(10～20 mg·L-1)抑制，在5 mg·L-1時(shí)達(dá)峰值，相比ck增加了6.43%，且與ck差異顯著(p<0.05),在20 mg·L-1時(shí)相比ck下降了13.24%，且與ck差異達(dá)極顯著水平(p<0.01)。在復(fù)合處理組中，淀粉酶活性與ck相比隨Cd處理濃度增加仍表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì)，其中復(fù)合處理組(Cd+pH 5)始終高于對(duì)應(yīng)的Cd單一處理組，隨酸性強(qiáng)度加大在復(fù)合處理組(Cd+pH 4)中，α-淀粉酶活性隨Cd處理濃度增加快速下降，表明高濃度Cd和高強(qiáng)度酸對(duì)酶活性有較強(qiáng)的抑制作用。

2.4 酸雨對(duì)Cd脅迫下大麥萌發(fā)種子呼吸速率的影響

呼吸速率可作為反映種子萌發(fā)過程中能量代謝狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)[13]。表2數(shù)據(jù)顯示，不同濃度Cd(5～20 mg·L-1)脅迫下，大麥萌發(fā)種子呼吸速率隨Cd濃度升高呈先升后降趨勢(shì)，與α-淀粉酶活性表現(xiàn)一致。在復(fù)合處理組(Cd+pH 5)中，(Cd 5+pH 5)組呼吸速率略高于ck，其余組合均低于ck，且隨Cd處理濃度增加而減小。隨著酸性增強(qiáng)，復(fù)合處理組(Cd+pH 4)顯著抑制呼吸速率，隨Cd處理濃度增加快速下降，且都低于對(duì)應(yīng)的Cd單一處理組，分別比ck降低了2.39%、17.11%、19.77%。說明弱酸對(duì)低濃度Cd處理種子呼吸速率的傷害有一定的緩解作用，而酸性加強(qiáng)時(shí)則表現(xiàn)為協(xié)同抑制作用。

3 討論與結(jié)論

作為植物生命周期起始點(diǎn)的種子萌發(fā)，能夠最早感受到逆境脅迫，種子萌發(fā)狀況直接影響作物后期發(fā)育[14]。已有研究表明，無毒的重金屬Cd變?yōu)橛坞x態(tài)Cd2+，與其他物質(zhì)化合后再被植物吸收，就會(huì)發(fā)揮出極大的毒性，并可富集于植物體內(nèi)，帶來持續(xù)傷害。本試驗(yàn)表明，在所處理的Cd濃度范圍內(nèi)，大麥種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)4個(gè)萌發(fā)指標(biāo)隨Cd濃度增加呈先升后降趨勢(shì)，鎘離子濃度越大，抑制效應(yīng)越強(qiáng)，此結(jié)果與曾翔等[5]和歐麗等[16]所得結(jié)果一致。低濃度Cd表現(xiàn)對(duì)植物種子萌發(fā)的正面促進(jìn)作用，原因可能是低濃度Cd促進(jìn)了植物細(xì)胞分裂，對(duì)其生長(zhǎng)有一定的刺激作用[17]，而高濃度Cd明顯抑制大麥種子萌發(fā)，對(duì)種子產(chǎn)生毒害作用，與羅良旭等[10]和崔大練等[18]的研究結(jié)果一致。當(dāng)Cd與酸雨復(fù)合在一起時(shí)，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低濃度Cd與弱酸雨處理組(Cd 5+pH 5)對(duì)大麥種子萌發(fā)表現(xiàn)為協(xié)同促進(jìn)作用，并且弱酸對(duì)高Cd濃度下種子萌發(fā)的傷害起到了一定的緩解作用，原因可能是酸雨加劇了對(duì)種皮的破壞而有利于其萌發(fā)。而隨酸雨強(qiáng)度加大，二者主要表現(xiàn)為協(xié)同抑制作用，加劇了對(duì)種子的毒害，使異狀發(fā)芽率升高(表1)，這與吳鵬等[19]的研究結(jié)果相同。

過量重金屬脅迫會(huì)抑制植物生長(zhǎng)[14]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，單一Cd脅迫下隨濃度增加，大麥幼苗的根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)、生物量均受到抑制而下降。這與周青等[20]和韓超等[21]的研究結(jié)果相同。已有研究表明，植物體內(nèi)積累過多的非必需Cd元素，會(huì)與Ca2+競(jìng)爭(zhēng)活性位點(diǎn)，導(dǎo)致被激活的CAM和Ca2+-ATP酶減少，并且會(huì)加速幼苗根系產(chǎn)生大量活性氧，抑制各種酶活性，細(xì)胞有絲分裂速度變慢，使根系生長(zhǎng)受阻，吸收和利用的礦質(zhì)元素減少，最終生物量降低[14]。當(dāng)Cd與酸雨復(fù)合在一起時(shí)，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在所處理的重金屬Cd濃度范圍內(nèi)(5～20 mg·L-1)與酸雨復(fù)合處理對(duì)大麥幼苗生長(zhǎng)的影響表現(xiàn)為協(xié)同抑制作用，并且酸性越強(qiáng)和Cd濃度越高對(duì)幼苗的傷害越大。這與李萌[3]的研究結(jié)果不相同，原因可能是試驗(yàn)材料對(duì)酸雨的抗逆性不同。

種子萌發(fā)初期，α-淀粉酶水解種子內(nèi)貯藏的淀粉為葡萄糖，用于幼苗的形態(tài)建成和生長(zhǎng)發(fā)育的物質(zhì)和能量來源，其活性強(qiáng)弱與種子萌發(fā)有著密切關(guān)系[22]。本研究表明，在5 mg·L-1的Cd濃度下大麥萌發(fā)種子α-淀粉酶活性與ck相比有增加，而后隨Cd濃度升高活性降低，表現(xiàn)為“低促高抑”，低濃度重金屬對(duì)植物積極的“刺激作用”[17],類似的結(jié)果在其它植物研究中也得到證實(shí)[23]。酸雨的加入，使不同濃度Cd與弱酸雨處理組(Cd+pH 5)的α-淀粉酶活性高于相應(yīng)的Cd單一處理組，尤其是低濃度組(Cd 5+pH 5)更為活躍，表現(xiàn)低濃度時(shí)二者對(duì)α-淀粉酶活性的協(xié)同促進(jìn)，而后隨酸雨強(qiáng)度增加快速下降，表現(xiàn)對(duì)α-淀粉酶活性的協(xié)同抑制。這與艾斯卡爾等的試驗(yàn)結(jié)果類似[24]。相關(guān)資料表明，α-淀粉酶是Ca2+依賴性酶，在高強(qiáng)度酸雨和高濃度Cd2+脅迫下,大量H+或Cd2+進(jìn)入胚細(xì)胞，影響酶分子氨基酸側(cè)鏈或占據(jù)Ca2+與淀粉酶的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致酶的構(gòu)象改變，酶活性降低[22]。

呼吸速率反映種子萌發(fā)過程中能量代謝狀態(tài)[6]。郝懷慶等研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的Hg2+能提高水鱉葉片呼吸速率，濃度升高則降低呼吸速率[25]。本研究結(jié)果與此類似，Cd脅迫后大麥萌發(fā)種子呼吸速率隨濃度增加先升后降，表現(xiàn)為低濃度時(shí)積極的刺激作用，這種促進(jìn)隨著弱酸雨的加入在復(fù)合處理組(Cd 5+pH 5)更加明顯，而后隨Cd濃度增加和酸雨強(qiáng)度加大呼吸速率開始下降，產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用。原因可能是低濃度下的Cd2+或弱酸雨促進(jìn)植物體內(nèi)的過氧化氫酶、過氧化物酶和酸性磷酸酶等的活性，促進(jìn)三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量，形成修復(fù)性增強(qiáng)呼吸作用，加強(qiáng)機(jī)體代謝，以抵御逆境造成的傷害，從而使呼吸代謝等在逆境條件下有異常升高的現(xiàn)象，但隨著Cd2+在細(xì)胞內(nèi)的積累，特別是在膜系統(tǒng)上附著的增加，線粒體結(jié)構(gòu)和功能遭受損傷和破壞，呼吸強(qiáng)度降低[26]，或者是因?yàn)榈蜐舛认碌腃d2+或弱酸雨使α-淀粉酶活性增高，產(chǎn)生較多可溶性糖，使呼吸作用所需底物增多從而加強(qiáng)呼吸速率。還可能是因?yàn)楦邼舛认碌腃d2+或H+損傷了細(xì)胞膜上的ATPase，擾亂了膜兩側(cè)的pH梯度，從而影響細(xì)胞呼吸代謝過程[27]。

綜上所述，酸雨對(duì)Cd脅迫下大麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)影響有所不同。各項(xiàng)種子萌發(fā)指標(biāo)表現(xiàn)為低Cd濃度(≤5 mg·L-1)和弱酸(pH=5.0)時(shí)的協(xié)同促進(jìn)作用與高Cd濃度(≥10 mg·L-1)和強(qiáng)酸(pH=4.0)時(shí)的抑制作用，而大麥幼苗的生長(zhǎng)則受到二者的協(xié)同抑制，酸雨的加入增加了對(duì)幼苗生長(zhǎng)的傷害。