常見菌草食（藥）用菌真菌性病原菌鑒定及生物學特性*

劉欣怡，雷雅婷，李 晶，魯國東，3，劉 斌,4，林占熺**

（1.福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建 福州 350002；2.國家菌草工程技術研究中心，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學植物保護學院，福建 福州 350002；4.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350013）

我國是世界最大的食（藥） 用菌生產(chǎn)和消費大國，然而傳統(tǒng)的食（藥）用菌栽培以闊葉樹為主要原料。據(jù)不完全統(tǒng)計每年至少有超4×106m3木材作為食（藥） 用菌栽培原料被消耗，造成了嚴重的“菌林矛盾”，嚴重制約菌業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。為了解決菌業(yè)發(fā)展中的瓶頸問題，福建農(nóng)林大學林占熺團隊開展利用芒萁、類蘆、斑茅、五節(jié)芒等野生草本植物，替代闊葉樹栽培香菇等食（藥）用菌的研究，并于1986年獲得成功。打破了“草腐菌”與“木腐菌”的界限，開創(chuàng)菌草研究新領域，開辟生態(tài)建設新途徑，創(chuàng)建菌草技術新體系，推動新興產(chǎn)業(yè)菌草業(yè)的發(fā)展，為菌草科學研究奠定了基礎。菌草栽培食用菌技術經(jīng)過30多年的推廣應用，到目前已篩選出45種菌草栽培55種食（藥） 用菌，緩解了“菌林矛盾”[2]。

菌草食（藥）用菌是指通過三級篩選的多種菌草配伍作為培養(yǎng)基栽培的食（藥）用菌。從感官評價和儀器質構分析，菌草食（藥）用菌的適口性更強。聶國添等[3]利用質構分析儀，分析比較以五節(jié)芒為主料栽培和常規(guī)栽培的糙皮側耳子實體的質構，結果以五節(jié)芒為主料栽培的糙皮側耳子實體的菌蓋咀嚼性、硬度和回復性以及菌柄回復性、硬度、內(nèi)聚性和咀嚼性，比常規(guī)以棉籽殼培養(yǎng)料栽培的子實體相對較低。從營養(yǎng)成分來看，菌草食（藥）用菌的營養(yǎng)成分均高于其他栽培料栽培的食（藥）用菌。戰(zhàn)琨友[4]分析菌草香菇的營養(yǎng)成分，結果發(fā)現(xiàn)粗蛋白含量是木屑香菇的1.9倍，有效多糖含量是木屑香菇的3.25倍，粗纖維素的含量比木屑香菇中的低，氨基酸總量和必需氨基酸比木屑香菇略高。蔡楊星等[5]分析菌草栽培猴頭菇子實體的粗蛋白、灰分、氨基酸總量分別是傳統(tǒng)木屑栽培的1.14倍、1.08倍、1.04倍，粗脂肪和總糖含量近似于傳統(tǒng)木屑栽培。曹秀明[6]研究了菌草灰樹花的粗蛋白、粗脂肪、氨基酸及灰分含量均高于木屑栽培的灰樹花。從食（藥）用菌含有的功能性物質方面來看，菌草食（藥）用菌含有的多糖、多糖肽以及三萜類物質均高于其他栽培料。陳凌華等[7]研究比較了菌草靈芝功能物質的組分和結構，結果表明菌草靈芝多糖、多糖肽和三萜類物質等功能性成分的含量、溶出率均高于或類似于其他栽培料的靈芝。從已有的研究結果分析，菌草食（藥）用菌的口感、營養(yǎng)成分以及含有的功能性物質等同于或優(yōu)于其他方式栽培食（藥）用菌。

隨著菌草技術在國內(nèi)外的大面積推廣和應用，在其生產(chǎn)的各階段過程中產(chǎn)生多種病害，從而出現(xiàn)食（藥）用菌產(chǎn)量減產(chǎn)、品質不佳等現(xiàn)象。為了解菌草食（藥）用菌栽培中常見真菌性病原菌的分類和特點，收集了在菌草食（藥）用菌（平菇Pleurotus ostreatus、香菇Lentinus edodes、靈芝Ganoderma lucidum） 中常見的真菌性病原菌若干種。利用ITS序列（internal transcribed spacer）對其開展了分子生物學鑒定[8]，以及溫度、光照、pH、培養(yǎng)基等對菌絲生長速度的影響的生物學特性研究，旨在為真菌性病原菌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集到食（藥） 用菌（平菇、香菇、靈芝） 真菌性病害菌株 LZ2、PG1、PG2、XG1、XG2、ZS2、ZS4，均保存于國家菌草工程技術研究中心。

SYM基礎培養(yǎng)基（starch yeast medium）：可溶性淀粉10 g、酵母提取物2 g、蔗糖3 g、瓊脂粉16 g，定容至1 L；不同碳源基礎培養(yǎng)基：KNO31 g、KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、碳源 5 g、瓊脂16 g，定容至1 L；不同氮源基礎培養(yǎng)基：KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、葡萄糖 5 g、氮源 1 g、瓊脂16 g，定容至1 L；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 供試樣品的DNA提取

收集新鮮培養(yǎng)的病原菌菌絲，采用CTAB法（cetyl trimethyl ammonium ammonium bromide） 提取gDNA[9]，并利用Nanodrop 2000對其進行質量檢測。

1.2.2 分子生物學鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

對收集到的病害樣本，采用真菌ITS通用引物ITS1 （5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’） 和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’） 對 ITS 序列進行PCR擴增[10]，反應體系為25 μL，包括DNA模板1 μL、引物各 1 μL、Mixer 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL，其反應條件為95℃預變性3 min；94℃變性2 min，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，32個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收后，由鉑尚生物技術（上海）有限公司進行測序，測序結果在NCBI中進行比對，并利用ClusterX和Mega 7.0進行系統(tǒng)發(fā)育樹繪制。

1.2.3 溫度對病原菌菌絲生長的影響

將上述經(jīng)鑒定后的病原菌接種到SYM平板上，28℃培養(yǎng)5 d后，用內(nèi)徑為5 mm的打孔器進行打孔后，將菌塊接種到SYM平板中間，于17℃、20℃、23℃、26℃、29℃、32℃和35℃條件下進行培養(yǎng)，每個處理5次重復，培養(yǎng)6 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，測定其生長速率。

1.2.4 pH值對病原菌菌絲生長的影響

按1.2.3的方法，將菌塊接種到pH值分別為5、6、7、8、9和10的SYM培養(yǎng)基平板中間，于29℃下培養(yǎng)6 d，每個處理5次重復，培養(yǎng)6 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，測定其生長速率。

1.2.5 光照對病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

按1.2.3的方法，將菌塊接種SYM培養(yǎng)基中間，于29℃分別置于全黑暗（24 h）、全光照（24 h）、半黑暗半光照（12 h更替）3種條件下培養(yǎng)6 d，每個處理5次重復，6 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，測定其生長速率[11]。

1.2.6 不同碳源對菌絲生長的影響

以SYM培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，用等量的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖和甘露醇代替培養(yǎng)基中可溶性淀粉（10 g），以無碳源培養(yǎng)基為對照（CK），接種相同大小菌塊，在29℃、pH 7和無光照條件下進行培養(yǎng)，每個處理5次重復，接種6 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，測定其生長速率。

1.2.7 不同氮源對菌絲生長的影響

以SYM培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，用等量的牛肉膏、蛋白胨、脲、磷酸氫二胺、草酸銨和酵母膏代替不同氮源基礎培養(yǎng)基中酵母提取物（2 g），以無氮源培養(yǎng)基為對照（CK），接種相同大小菌種塊，置于29℃、pH 7和黑暗條件下進行培養(yǎng)，每個處理5次重復，接種6 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，測定其生長速率。

圖1 供試病原菌菌株基于ITS堿基序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of tested pathogens strain based on ITS base sequences

2 結果與分析

2.1 真菌性病原菌分子生物學鑒定

采用ITS1和ITS4對樣品DNA進行擴增，均能獲得500 bp～600 bp片段。對獲得的全部片段在NCBI上進行BLAST分析，并利用ClusterX和Mega 7.0進行系統(tǒng)發(fā)育樹繪制，見圖1。

圖1中LINGZHI2后簡稱為LZ2，PINGGU1為PG1，PINGGU2為PG2，XIANGGU1為 XG1，XIANGGU2為 XG2，ZHUSUN2為 ZS2，ZHUSUN4為ZS4。從圖1看出，菌株LZ2、PG2和XG1與哈茨木霉Trichoderma harzianum的同源性高達99%（第一類），菌株 ZS2和 ZS4與蠟孔菌 Ceriporia lacerata的同源性高達99%（第二類），菌株XG2與赭曲霉Aspergillus ochraceus（第三類） 等同源性高達98%，而菌株PG1則是與側耳木霉Trichoderma pleuroticola（第四類） 的同源性高達99%。同時，結合形態(tài)特征認為所收集的病原菌主要分為以上4類，并對鑒定分離后的病原菌菌株分別命名為TH-1、CL-1、AO-1 和 TP-1。

2.2 不同溫度對4種病原菌菌株菌絲生長的影響

不同溫度對4種病原菌菌株菌絲生長的影響見表1。

表1 溫度對病原菌菌株菌絲生長的影響Tab.1 Effects of temperature on mycelia growth of pathogens strains

從表1可以看出，4種病原菌菌株在19℃～35℃溫度范圍和全黑暗條件下菌絲均能正常生長，其中菌絲生長的最適范圍在 26℃～32℃，菌株AO-1、TP-1、TH-1和CL-1菌絲生長速率最高分別達到（0.670± 0.113） cm·d-1、 （1.893± 0.049） cm·d-1、（1.995± 0.037） cm·d-1和 （2.006± 0.025） cm·d-1，屬于中高溫型病原菌。

2.3 不同pH值對病原菌菌絲生長的影響

將4種病原菌接種到pH值為5～10的培養(yǎng)基上，在29℃全黑暗條件下培養(yǎng)，其菌絲能正常生長，具體見表2所示。

表2 pH值對4種病原菌菌株菌絲生長的影響Tab.2 Effects of pH value on mycelia growth of 4 kinds of pathogens strains

從表2可以看出，在pH值為6～8的條件下4種病原菌均可以生長且菌絲體速率達到最高，菌株AO-1、TP-1、TH-1和CL-1菌絲最大生長速率分別為 （0.610±0.032） cm·d-1、 （2.027±0.068）cm·d-1、 （2.005±0.112） cm·d-1和 （2.007± 0.066）cm·d-1，結果認為當培養(yǎng)基pH接近中性時為最適合菌絲生長。

2.4 光照對4種病原菌菌絲生長的影響

不同光照條件對4種病原菌菌株菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響如表3所示。

從表3可以看出，4種病原菌菌株在光照或黑暗培養(yǎng)條件下均能夠生長，且光照對產(chǎn)孢具有一定的促進作用，而黑暗對產(chǎn)孢作用具有顯著的抑制作用；而在黑暗條件下菌絲體生長比其他條件下生長旺盛。

2.5 不同碳源對4種病原菌菌株菌絲生長的影響

不同碳源對4種病原菌菌株菌絲生長的影響，如圖2所示，圖2中*表示在0.05水平上差異顯著。

圖2結果發(fā)現(xiàn)，4種病原菌在多種碳源培養(yǎng)基上均能生長，其中在培養(yǎng)基中分別添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖和甘露糖可使菌株CL-1和TP-1菌絲正常生長；在培養(yǎng)基中分別添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖和甘露糖的培養(yǎng)基上可使TH-1菌絲正常生長；在培養(yǎng)基中分別添加蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖和甘露糖的培養(yǎng)基上可使菌株AO-1菌絲正常生長。

表3 不同光照條件對4種病原菌菌株菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響Tab.3 Effects of different light conditions on mycelia growth and spore germination of 4 kinds of pathogens strains

2.6 不同氮源對菌絲生長的影響

不同氮源對4種病原菌菌株菌絲生長的影響如圖3所示，圖3中*表示在0.05水平上差異顯著。

經(jīng)比較6種氮源對4種病原菌菌株的菌絲生長直徑的影響表明，4種病原菌菌株對有機氮的利用不佳，而在無機氮培養(yǎng)基上能較好的生長，對于菌株CL-1、TH-1、AO-1可以較好地利用牛肉膏、蛋白胨、草酸銨和酵母膏等無機氮，而菌株TP-1僅能較好地利用磷酸氫二胺。

圖2 不同碳源對4種病原菌菌株菌落生長的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on the colony growth of 4 kinds of pathogens strains

圖3 不同氮源對4種病原菌菌株菌落生長的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on the colony growth of 4 kinds of pathogens strains

3 討論

本研究通過從常見食（藥）用菌（平菇、香菇、靈芝）上分離得到7種病原菌，經(jīng)ITS序列分析得到4種不同的病原菌菌株，分別為哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、蠟孔菌 （Ceriporia lacerata）、赭曲霉（Aspergillus ochraceus） 和側耳木霉（Trichoderma pleuroticola）。其中哈茨木霉（Trichoderma harzianum）在番茄、棉花、水稻、玉米等農(nóng)作物上作為生防菌[12]得以廣泛應用，能抑制番茄灰霉病、葉霉病、枯萎病及褐斑病等[13]；與枯草芽孢桿菌一起對棉花枯黃萎病等具有拮抗作用[14]；同時，哈茨木霉還廣泛地應用于抑制水稻紋枯病、惡苗病菌等，具有顯著的抑制作用[15-16]。赭曲霉廣泛存在于水果、谷物等作物中并產(chǎn)生赭曲霉毒素A，能產(chǎn)生強腎毒性，具有致癌、致畸、致突變等作用，危害人畜健康、嚴重威脅生命安全[17]，從葡萄中分離的赭曲霉經(jīng)生物學特性研究發(fā)現(xiàn)其最適生長溫度在30℃，利用枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液和無菌體發(fā)酵液在瓊脂板上均能顯著抑制赭曲霉的生長。蠟孔菌在櫻桃等水果中廣泛存在并導致其根莖腐爛致死[18]。

然而類似的病原菌也曾在食（藥）用菌的研究中被報道過，吳小平等[19-20]對食用菌栽培過程中出現(xiàn)的木霉菌種類進行調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)哈茨木霉和長枝木霉分別為食用菌栽培中出現(xiàn)頻率最高的木霉菌，分別為59%和31%。曹現(xiàn)濤[21]和覃培升[22]分別從香菇菌筒和平菇培養(yǎng)料中分離除了側耳木霉，并研究其最適溫度為30℃～35℃，最適含水量為80%，最適pH值為7。哈慈木霉能抑制靈芝、香菇等食用菌菌絲體生長從而導致食用菌減產(chǎn)，給生產(chǎn)帶來嚴重經(jīng)濟危害[23-24]。陳桂仙從真姬菇菌袋中分離出撕裂蠟孔菌（Ceriporia lacerata），得到其最適生長溫度為15℃～35℃，最適pH為5～6，并在栽培料中加入適當生石灰用于防治該疾病[25]；圖力古爾對撕裂蠟孔菌的生物學特性研究也發(fā)現(xiàn)其最佳生長溫度為30℃，pH為5[26]。赭曲霉作為毒素較強的一種真菌性病原菌在食用菌上的研究較少，而在本研究中發(fā)現(xiàn)其在食用菌上也大量存在，因此，有效地抑制和防治該真菌性病害在食用菌上的傳播顯得尤為重要。

本研究中利用ITS序列分析鑒定到的4種病原菌，均在食（藥） 用菌（平菇、香菇、靈芝） 菌絲體生長階段感染正常菌絲的生長，導致菌絲體無法正常生長或畸形，從而引起食（藥）用菌減產(chǎn)或絕產(chǎn)，需在防治之前開展相關的生物學特性研究，然而本研究對于孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)條件的研究還需要不斷深入和補充。因此，對于食用菌上常見的病害研究還需要在工廠化栽培、分子診斷和毒力試驗上繼續(xù)開展。