肉桂醛促進子宮內(nèi)膜癌RL95-2細胞凋亡的機制

陳立平，王柏欣，王景濤，符 婕，魏 宏，張東東，劉 蕾

（1.佳木斯市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，

2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007）

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，位居女性惡性腫瘤第四位［1-2］。肉桂醛是樟科植物肉桂揮發(fā)油的主要成分，肉桂醛做為一種天然活性成分，具有抗氧化、降血糖、抗炎、抗病毒和解熱鎮(zhèn)痛等多種藥理作用，可抑制Wnt/β-catenin信號通路誘導(dǎo)三種非小細胞肺癌細胞凋亡，并通過抑制核因子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）和核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（alkalinephosphataseactivatorprotein-1，AP1）活性，誘導(dǎo)黑素瘤細胞凋亡、抗肺癌和黑素瘤［3-7］。肉桂醛對子宮內(nèi)膜癌研究尚未見報道，本研究通過肉桂醛作用子宮內(nèi)膜癌RL95-2細胞檢測NF-κB、白介素-6（interleukin-6，IL-6）和胰島素樣生長因子受體（insulin-like growth factor receptor，IGF-R）蛋白表達，探討肉桂醛對子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

RL95-2細胞株由佳木斯大學(xué)病理生理學(xué)教研室保存。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗（青霉素-鏈霉素）均購自美國Gibco公司，MTT購自美國Sigma公司；BCA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Caspase-3、β-actin、NF-κB·p65、IL-6和IGF-R抗體均購自美國Santa公司；Cleaved caspase-3抗體購自美國CST公司；Annexin V-FITC/7AAD凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

RL95-2細胞用體積分數(shù)10%DMEM培養(yǎng)液（含10%血清、1%雙抗）置于37℃、體積分數(shù)5%CO2常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 藥物配制

用體積分數(shù)10%DMEM細胞培養(yǎng)液將25 mg/mL的肉桂醛貯存液（1‰DMSO）按1∶8稀釋后依次2倍倍比稀釋，0.22 μm有機微孔濾器抽濾除菌，4℃保存。

1.4 細胞活性測定

RL95-2細胞用0.25 g/L胰酶消化，以濃度為2.5×105個/mL每孔200 μL細胞懸液鋪板，設(shè)置空白對照、細胞對照和溶劑對照，37℃，體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)12 h，將不同濃度肉桂醛加入96孔板，空白對照孔和細胞對照孔加入體積分數(shù)10%DMEM培養(yǎng)液，溶劑對照孔加入10%DMEM培養(yǎng)液（含有1‰ DMSO），分別培養(yǎng)24、48和72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，PBS沖洗2次，每孔各加入180 μL體積分數(shù)10%DMEM培養(yǎng)液和20 μL（5 mg/mL）MTT溶液混勻，37℃培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀（波長490和570 nm）檢測，細胞存活率＝A實驗組/A對照組×100%，實驗重復(fù)3次。

1.5 流式細胞術(shù)檢測RL95-2細胞凋亡百分率

不同濃度肉桂醛和10%DMEM培養(yǎng)液（含有1‰DMSO）作用RL95-2細胞48 h后，細胞用體積分數(shù)0.25%的胰酶消化，1 000 r/min（r=14.5 cm）5 min收集細胞，緩沖液重懸細胞，調(diào)至細胞濃度為1×106個/mL，取100 μL細胞懸液，分別加入5 μL Annexin V-FITC和7AAD，避光孵育15 min，流式細胞儀（BD公司）檢測。

1.6 Hoechst33258染色檢測RL95-2細胞凋亡

不同濃度肉桂醛和10%DMEM培養(yǎng)液（含有1‰ DMSO）作用RL95-2細胞48 h后，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 mL固定液，固定10 min，吸去固定液，PBS液輕輕漂洗2遍，每次3 min，加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min，吸去染色液，PBS液輕輕漂洗2遍，每次3 min，滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，置熒光顯微鏡下激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm觀察并分析，實驗重復(fù)3次。

1.7 Western blot檢測Cleaved caspase-3、Caspase-3、NF-κB·p65、IL-6和IGF-R蛋白表達

不同濃度肉桂醛和10%DMEM培養(yǎng)液（含有1‰ DMSO）作用RL95-2細胞48 h后，TBS洗滌3次，RIPA緩沖液裂解收集蛋白。BCA試劑盒測定細胞裂解液中的蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)，樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBS洗滌3次，二抗37℃孵育1 h，ECL檢測試劑盒檢測，實驗重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

用SAS（9.13版）軟件處理數(shù)據(jù)，定量資料服從正態(tài)分布，采用（X±S）表示，多組間比較數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊，采用完全隨機設(shè)計的方差分析，實驗組與對照組比較采用Dunnett t檢驗，檢驗為雙側(cè)檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞活性測定

不同濃度肉桂醛作用RL95-2細胞可降低子宮內(nèi)膜癌RL95-2細胞增殖率（圖1）。隨著藥物濃度增加和作用時間延長，細胞增殖率逐漸降低。肉桂醛作用RL95-2細胞24、48和72 h的IC50值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=228.74，P=0.000 0），IC50值分別為（1.18±0.08）、（0.59±0.06）和（0.13±0.03）mg/mL（48 h與24 h比較，P=0.000 5；72 h與24 h比較，P=0.000 0；72 h與48 h比較，P=0.000 3）。

圖1 細胞增殖率的變化Fig.1 Cell viability by MTT assay

2.2 Hoechst33258染色檢測RL95-2細胞形態(tài)學(xué)變化

不同濃度肉桂醛作用48 h后，RL95-2細胞出現(xiàn)細胞凋亡的典型變化，細胞核固縮，致密濃染、邊集，有的斷裂成大小不一碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)白，而對照組細胞核形規(guī)則，呈彌散均勻的淡藍色熒光（圖2，箭頭所示為凋亡小體）。

圖2 RL95-2細胞凋亡形態(tài)學(xué)的變化Fig.2 The apoptosis morphologic changes of RL95-2 cells

2.3 流式細胞術(shù)檢測RL95-2細胞凋亡百分率

各組RL95-2細胞凋亡百分率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=69.53，P=0.0000）。肉桂醛（0.29、0.59、1.20 mg/mL）組RL95-2細胞凋亡百分率明顯高于溶劑對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01；圖3），結(jié)果進一步說明肉桂醛可促進RL95-2細胞的凋亡。

圖3 RL95-2細胞凋亡率的變化Fig.3 The apoptosis rates of RL95-2 cells

2.4 Western blot檢測Cleaved caspase-3、Caspase-3、NF-κB·p65、IL-6和IGF-R蛋白表達

各組RL95-2細胞Cleaved caspase-3蛋白的表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=30.22，P=0.000 1），D各組RL95-2細胞NF-κB·p65蛋白的表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=22.12，P=0.000 3），各組RL95-2細胞IL-6蛋白的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=58.73，P=0.000 0），各組RL95-2細胞IGF-R蛋白的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=67.43，P=0.000 0），而各組RL95-2細胞caspase-3蛋白的表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.61，P=0.0652）。與溶劑對照組比較，肉桂醛（0.29、0.59、1.20 mg/mL）組RL95-2細胞Cleaved caspase-3蛋白的表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而肉桂醛（0.29、0.59和1.20 mg/mL）組RL95-2細胞NF-κB·p65、IL-6和IGF-R蛋白的表達均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05；圖4）。

圖4 RL95-2細胞Cleaved caspase-3、Caspase-3、NF-κB·p65、IL-6和IGF-R蛋白表達Fig.4 Expression of Cleaved caspase-3，Caspase-3，NF-κB·p65，IL-6 and IGF-R in RL95-2 cells

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是源自子宮內(nèi)膜上皮的惡性腫瘤，近年來子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率顯著增加，發(fā)病年齡趨于年輕化。雖然子宮內(nèi)膜癌的診斷和治療方面取得了巨大進步，但30%的患者確診即為晚期［8］。雖然手術(shù)可切除腫瘤，但是在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管、放療、化療和造血系統(tǒng)中存在殘留的腫瘤栓子，預(yù)后不理想。因此開展子宮內(nèi)膜癌的藥物治療研究尤為重要。

肉桂醛是肉桂精油的主要化學(xué)成分，是FDA批準(zhǔn)的食品添加劑，具有公認的安全性，并且在FDA批準(zhǔn)的口服劑量下具有廣泛的無毒性記錄［9］。肉桂醛可抑制宮頸癌、肺癌等細胞增殖，還可以通過CASP-8/t-Bid途徑等多種機制參與內(nèi)在（線粒體介導(dǎo)的）和外在（死亡受體介導(dǎo)的）HCC細胞凋亡［10］。本實驗采用不同濃度肉桂醛作用子宮內(nèi)膜癌RL95-2細胞，分別在24、48和72 h檢測細胞存活率，發(fā)現(xiàn)RL95-2細胞存活率的下降與藥物濃度和作用時間有關(guān)。隨著作用濃度增加和作用時間延長RL95-2細胞存活率逐漸降低，結(jié)果表明肉桂醛有抑制子宮內(nèi)膜癌RL95-2細胞增殖的作用。我們進一步采用流式細胞術(shù)和Hoechst33258檢測RL95-2細胞凋亡，對照組細胞核形規(guī)則，呈彌散均勻的淡藍色熒光（圖2），凋亡率為4.12%，而肉桂醛作用后RL95-2細胞凋亡率明顯增加為11.85%、15.13%和24.32%，RL95-2細胞出現(xiàn)細胞凋亡的典型變化，細胞核固縮，致密濃染、邊集，有的斷裂成大小不一碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)白，凋亡蛋白Cleaved caspase-3的表達增加（圖4），表明肉桂醛通過活化caspase-3促進RL95-2細胞凋亡。

細胞凋亡與兩種主要途徑相關(guān)，包括死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑，半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族對于這兩條途徑引起的細胞凋亡是必要的，而caspase-3是最關(guān)鍵的執(zhí)行者。死亡受體途徑始于Fas活化，激活caspase-8，而線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑始于線粒體膜電位喪失，細胞色素C釋放，進而激活caspase-9，兩種主要途徑最終都活化caspase-3引發(fā)細胞凋亡。許多信號通路可通過死亡受體和線粒體途徑最終剪切活化caspase-3蛋白，導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。為了進一步了解肉桂醛活化caspase-3促進RL95-2細胞凋亡的機制，我們研究了NF-κB·p65、IL-6和IGF-R在其中的作用。核因子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）是一種多效轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)許多基因的表達抗細胞凋亡，促進腫瘤細胞生長、存活和腫瘤轉(zhuǎn)化，而NF-κB的下調(diào)可通過線粒體介導(dǎo)的caspase-3依賴性途徑抑制細胞增殖，促進細胞凋亡［11-12］。白介素-6（interleukin-6，IL-6）可調(diào)控子宮內(nèi)膜細胞周期，細胞分化，細胞遷移，IL-6可通過抑制線粒體途徑凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達，抑制caspase-3活化，參與腫瘤發(fā)生、進展和化療耐藥，而IL-6的活性降低可增加Cleaved caspase-3水平促進腫瘤細胞凋亡［13-16］。胰島素樣生長因子受體（Insulin-like growth factor receptor，IGF-R）可調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的生長和分泌，保持子宮內(nèi)膜完整，且在細胞增殖、凋亡以及子宮內(nèi)膜癌形成、進展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，IGF1R siRNA可通過激活死亡受體途徑Caspase-8蛋白表達，增強了caspase-3依賴性細胞凋亡［17］。本實驗使用不同濃度肉桂醛作用宮內(nèi)膜癌RL95-2細胞48 h后，Western blot檢測RL95-2細胞NF-κB·p65、IL-6和IGF-R蛋白的表達降低，Cleaved caspase-3蛋白的表達增加（圖4），結(jié)果顯示肉桂醛可能通過降低NF-κB·p65、IL-6和IGF-R蛋白水平，分別經(jīng)由死亡受體和線粒體途徑增加Cleaved caspase-3蛋白的表達，進而促進腫瘤RL95-2細胞凋亡。

綜上所述，我們的研究表明，肉桂醛可使子宮內(nèi)膜癌RL95-2細胞活力下降，誘導(dǎo)細胞凋亡，其機制可能與下調(diào)NF-kB·p65、IL-6和IGF-R表達有關(guān)。但是肉桂醛抑制子宮內(nèi)膜癌RL95-2細胞增殖過程中NF-κB·p65、IL-6、IGF-R三者之間是否存在互相調(diào)控機制以及是否涉及到其他信號分子或信號通路仍需進一步的體外和體內(nèi)實驗來研究。