不同花源蜂蜜蛋白質組分及提取方法的比較

張穎，張光艷，王宇翔，曹煒

(西北大學 食品科學與工程學院，陜西 西安，710069)

蜂蜜是大自然賜予人類的珍貴禮品，富含葡萄糖、果糖、蛋白質、氨基酸、維生素、微量元素及酚類等多種營養(yǎng)物質，在抑菌、抗氧化、提高免疫力、抗突變和消炎等方面具有獨特的生理功能[1-3]。我國是世界蜂蜜生產(chǎn)大國，洋槐蜜、荊條蜜、油菜蜜、棗花蜜、龍眼蜜等大宗單花種蜂蜜深受國內(nèi)外消費者青睞。然而，現(xiàn)行蜂蜜標準中缺乏有效區(qū)分蜂蜜花源的內(nèi)在質量指標，受利益因素驅使，在商品價值較高蜂蜜品種中摻入廉價蜂蜜的現(xiàn)象普遍存在[4-5]。因此，亟需加強對蜂蜜花源鑒別技術和方法的研究開發(fā)。

蜂蜜中約含有0.02%～0.5%蛋白質，近年來國內(nèi)外一些研究表明，蛋白質可以作為蜂蜜中的特征內(nèi)標成分，用來鑒別蜂蜜的花源、蜂種以及地理源[6-11]。IGLESIAS等采用快速蛋白質液相色譜分析西班牙花蜜和甘露蜜，發(fā)現(xiàn)兩類蜂蜜中存在特有的蛋白色譜峰[7]。SONG等通過研究枇杷蜜與油菜蜜中植物源幾丁質酶活性的差異，認為植物源幾丁質酶可作為潛在的蛋白標志分子來識別枇杷蜜[9]。鄧建軍等分析了蕎麥蜜和摻假蕎麥蜜SDS-PAGE圖譜的差異，認為從蛋白質角度可為鑒別蜂蜜真?zhèn)伍_辟一條新途徑[11]。然而目前相關研究主要針對國外蜂蜜品種，有關中國各種特色蜂蜜中的蛋白質組成差異以及特征標識蛋白研究尚處于起步階段。

因此，本文以棗花蜜、荊條蜜、龍眼蜜、土蜂蜜、洋槐蜜和油菜蜜為研究對象，首先通過考馬斯亮藍和銀氨2種染色方法比較不同花源蜂蜜蛋白質電泳行為的差異；然后采用超濾法和硫酸-鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白質，利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和反相高效液相色譜(reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)分析2種蛋白質提取方法的適用性和分離效果，以期為探尋中國特色蜂蜜中蛋白質標識物、構建蜂蜜花源溯源和質量評價技術奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6種蜂蜜樣品信息：棗花蜜采自陜西佳縣(2016年)、荊條蜜采自河南輝縣(2013年)、龍眼蜜采自廣東茂名(2012年)、土蜂蜜采自陜西漢中(2015年)、洋槐蜜采自甘肅清水(2017年)、油菜蜜采自陜西漢中(2014年)，所有蜂蜜從蜂場采集、運至實驗室后于4 ℃保存待用。

低分子質量蛋白質Marker(14.4～97.4kDa)，北京索萊寶科技有限公司；牛血清蛋白(純度≥99%)，美國Amresco公司；考馬斯亮藍G-250和R-250、丙烯酰胺、N,N-亞甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基甲烷、甘氨酸，西安科昊生物工程有限公司；鎢酸鈉、三氟乙酸(色譜級)、乙腈(色譜級)、AgNO3、Na2CO3、乙二胺四乙酸二鈉，天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA224S電子分析天平(精度0.1 mg)，北京賽多利斯科學儀器有限公司；HH-S4電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；TGL-16G高速冷凍離機，上海安亭科學儀器廠；722G可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；8 400超濾杯，美國Millipore公司；Five easy plus pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DYCZ-24雙垂直蛋白電泳儀，北京六一儀器廠；FD-1冷凍干燥機，西安予輝儀器有限公司；U-3000高效液相色譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂蜜蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍法測定蜂蜜蛋白質含量[12]。100 μL不同濃度牛血清蛋白標準溶液與5 mL考馬斯亮藍G250溶液中混勻，室溫下反應5 min，使用紫外/可見分光光度計于595 nm處測定吸光值，以吸光值為縱坐標，牛血清蛋白含量為橫坐標繪制標準曲線。5 g蜂蜜溶于5 mL去離子水中，4 500 r/min下離心10 min，吸取100 μL上清液與5 mL考馬斯亮藍液中混勻，室溫下反應5 min，于595 nm處測定吸光值，根據(jù)吸光值計算蜂蜜蛋白質含量。

1.3.2 超濾法提取蜂蜜蛋白質

參考WON等[13]方法對蜂蜜中蛋白進行超濾分離。90 g蜂蜜溶于90 mL去離子水，混勻后于4 500 r/min下離心10 min，收集上清液，置于截留分子質量3 500 Da透析袋中透析4次，透析結束后經(jīng)5 000 Da濾膜超濾濃縮，收集濃縮蜂蜜蛋白液，然后真空干燥成凍干粉，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 硫酸-鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白質

參考AOAC方法[14]采用硫酸-鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白。12 g蜂蜜于50 mL離心管中，加入4 mL去離子水混勻，將2 mL 100 mg/mL鎢酸鈉溶液和2 mL 0.335 mol/L H2SO4溶液迅速混勻后，加到蜂蜜樣品離心管中混勻，然后80 ℃水浴30 min，水浴過程中每隔5 min旋轉離心管30 s，不斷有絮狀沉淀析出。水浴結束后，用水反復洗滌沉淀物5次，倒去上清液，將蜂蜜蛋白沉淀真空干燥成凍干粉，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 蜂蜜蛋白質SDS-PAGE分析

對于蜂蜜樣品，6 g蜂蜜與去離子水1∶1混勻，進行或不進行離心處理(離心參數(shù)：4 500 r/min離心10 min)， 取上清液備用；對于超濾法和鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白，稱取蜂蜜蛋白粉0.1 g溶于2 mL去離子水備用。電泳參考CHEVALLET等方法[15]進行，采用4%濃縮膠和12%分離膠，將蜂蜜或蜂蜜蛋白溶液與樣品緩沖液1∶1混合，沸水加熱3～5 min，迅速冷卻至室溫，然后上樣20 μL，Marker上樣10 μL。 凝膠電泳電壓開始設定為80 V，待進入分離膠后調(diào)整為120 V，電泳結束后進行考馬斯亮藍R250染色或銀氨染色，終止顯色后拍照。

1.3.5 蜂蜜蛋白質RP-HPLC分析

分別稱取0.25 g超濾法和0.1 g鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白粉溶于1 mL超純水，然后過0.45 μm濾膜，參考ZHANG等方法[16]并適當修正進行RP-HPLC分析。色譜條件：色譜柱：C18，5 μm，250 mm×4.6 mm i.d，80 ?；流動相A：含0.1%三氟乙酸的水；流動相B：含0.1%三氟乙酸的乙腈；進樣量：20 μL； 流速：1 mL/min；檢測波長：215 nm；檢測溫度：30 ℃；洗脫程序：0～5 min B為10%；5～40 min B從10%到80%；40～50 min B從80%到10%；50～60 min B為10%；60 min停止。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗重復3次，采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學顯著性分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示，且P<0.05認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同花源蜂蜜蛋白質含量的比較

如表1所示，6種不同花源蜂蜜中蛋白質含量分布在395.49～944.51 mg/kg，按照含量高低依次為棗花蜜(944.51±38.04)mg/kg、龍眼蜜(801.37±15.49)mg/kg、土蜂蜜(609.22±18.04)mg/kg、洋槐蜜(528.82±65.10)mg/kg、油菜蜜(432.75±20.20)mg/kg、荊條蜜(395.49±12.75)mg/kg。很多研究顯示蜂蜜中約含有0.1%～0.5%蛋白質，但這些通常是采用凱氏定氮法通過測定蜂蜜總氮含量計算得到，但蜂蜜中總氮僅有40%～80%來自蛋白質成分，其余則來自游離氨基酸，因此通過凱氏定氮法測定蜂蜜蛋白質含量會導致數(shù)據(jù)比實際值偏高[17-18]。蜂蜜中蛋白質組分有兩類來源：一類是來自于蜜源植物的花粉、花蜜以及滲出物，另一類則來自蜜蜂自身分泌物[19-20]。6種不同花源蜂蜜的蛋白質含量在種類間差異顯著(表1)，這可能是由于不同蜜源植物花蜜或花粉中所含蛋白質含量差異造成的。

表1 不同花源蜂蜜中蛋白質含量Table 1 Protein content of honeyfrom different floral origin

注：同一行具有不同字母數(shù)據(jù)之間代表顯著差異(P<0.05)。

2.2 不同花源蜂蜜蛋白質電泳行為分析

蜂蜜中含有少量的蜜源植物花粉，而花粉是蜂蜜中蛋白質成分的一個重要來源，為了觀察花粉對蜂蜜蛋白質電泳行為是否會產(chǎn)生影響，電泳前對蜂蜜樣品分別進行離心和不離心預處理，電泳結束經(jīng)考馬斯亮藍染色后如圖1-A和1-B所示。由圖1-A和1-B可以看出，離心與否對蜂蜜蛋白質SDS-PAGE圖譜影響不明顯，無論是否經(jīng)離心預處理，6種不同花源蜂蜜中蛋白質均主要集中在分子質量43～97.4 kDa，然而此區(qū)間高豐度蛋白條帶的分子質量和顏色深淺在蜂蜜品種間有明顯區(qū)別；對于棗花蜜、龍眼蜜和土蜂蜜，在> 97.4 kDa明顯存在一些高分子質量蛋白。這說明6種花源蜂蜜中主要蛋白質組分有一定相似性，但在組成和含量上存在差異。文獻中已鑒定的蜂蜜蛋白包括蜂王漿主蛋白MRJP-1～5、MRJP-7以及α-葡萄糖苷酶等，其分子質量均處于50～80 kDa[20-22]。另外，對于棗花蜜，分子質量約19 kDa處存在1條高豐度蛋白條帶，而在其他5種蜂蜜中并不明顯(圖1-A和1-B)，這可能預示著此蛋白質帶可作為棗花蜜的特征花源標識成分。

除考馬斯亮藍染色外，銀氨染色也常在電泳中用于蛋白質顯色，其作為一種高靈敏度蛋白質染色方法，在SDS-PAGE圖譜中可以更清晰地表征蛋白質組分的差異和變化。圖1-C顯示的是6種蜂蜜銀染蛋白質SDS-PAGE圖譜，可以看出，與考染相比，銀染將6種蜂蜜蛋白質組分差異更清晰地呈現(xiàn)：除43～97.4 kDa高豐度蛋白，棗花蜜、荊條蜜、龍眼蜜、土蜂蜜和油菜蜜在31～43 kDa存在豐富的次豐度蛋白，而棗花蜜、龍眼蜜和土蜂蜜中<31 kDa和>97.4 kDa蛋白也被更好顯現(xiàn)出來。由此可知，6種不同花源中國蜂蜜中蛋白質分子質量遍布于14.4～97.4 kDa，甚至部分品種在> 97.4 kDa還存在較多的高分子質量蛋白。MARSHALL等1987年首次采用銀染SDS-PAGE將澳大利亞蜂蜜中分子質量分布于10～150 kDa的19個蛋白條帶呈現(xiàn)出來[23]。BAUER等采用考染SDS-PAGE研究洋槐蜜、葵花蜜、栗子蜜、森林蜜時，分布于10.5～72 kDa的多條蛋白帶被檢測[24]。

比較6種蜂蜜的考染和銀染SDS-PAGE圖譜，棗花蜜考染圖譜中19 kDa附近的單一蛋白帶(圖1-A和1-B)在銀染圖譜上呈現(xiàn)為2個明顯條帶(圖1-C)，這說明其由2個分子質量非常接近的蛋白組分構成；而對于其他5種蜂蜜，雖在銀染圖譜19 kDa附近也顯現(xiàn)出微弱的蛋白帶，但與棗花蜜相比含量非常低微(圖1-C)。另外，在分子質量24 kDa附近，荊條蜜、龍眼蜜、土蜂蜜、洋槐蜜和油菜蜜的銀染圖譜中出現(xiàn)明顯蛋白帶，但在棗花蜜中并不明顯(圖1-C)，因此，可利用此蛋白組分應用于其他5種蜂蜜尤其是低價格油菜蜜摻入到棗花蜜中的摻假鑒別。

A和B-考馬斯亮藍染色，A-離心預處理、B-不離心預處理；C-銀氨染色；其中泳道M為Marker，泳道1-6分別為棗花蜜、荊條蜜、龍眼蜜、土蜂蜜、洋槐蜜和油菜蜜圖1 不同花源蜂蜜蛋白質SDS-PAGE圖譜Fig.1 The SDS-PAGE profiles of honey protein from different floral origin

2.3 不同花源蜂蜜提取蛋白SDS-PAGE分析

蜂蜜中僅含有痕量蛋白質，而其中大量存在的葡萄糖、果糖以及酚酸、黃酮等小分子代謝成分均可能會干擾蜂蜜蛋白質的結構表征，采取合適的方法將蜂蜜中蛋白質分離出來是準確全面鑒定蜂蜜蛋白質種類的前提[21]。文獻報道的蜂蜜蛋白質提取分離方法主要分為兩類：物理法(超濾、色譜法等)和化學沉淀法(硫酸-鎢酸鈉、硫酸銨、TCA丙酮法等)，而其中的超濾分離和硫酸-鎢酸鈉沉淀被認為是提取蜂蜜蛋白最為有效的2種方法[18,21]。因此，本研究比較分析了超濾法和鎢酸鈉沉淀法分離6種中國蜂蜜蛋白質的適用性及效果。

超濾法提取蜂蜜蛋白質SDS-PAGE圖譜如圖2-A所示，與原始蜂蜜相比(圖1-A)，超濾法有效濃縮了棗花蜜、荊條蜜、土蜂蜜、洋槐蜜和油菜蜜中高豐度蛋白，在電泳圖譜中表現(xiàn)為43～97.4 kDa的蛋白條帶緊密聚集而不能分開，并且對<43 kDa甚至是14.4 kDa以下的次豐度蛋白組分也有不等程度富集效果(圖2-A，泳道1、2、4、5和6)。由此可知，超濾法實現(xiàn)了對此5種蜂蜜蛋白質的有效分離。但對于龍眼蜜，與原始蜂蜜樣品相比(圖1-A，泳道3)，超濾分離并沒有明顯增加電泳圖譜中蛋白質條帶的數(shù)量和含量(圖2-A，泳道3)。

圖2-B顯示的是硫酸-鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白質SDS-PAGE圖譜。與超濾法相比，洋槐蜜、油菜蜜尤其是荊條蜜中43～97.4 kDa高豐度蛋白的含量明顯降低，<43 kDa次豐度蛋白條帶也有一定程度減少(圖2-B，泳道2、5和6)，而棗花蜜SDS-PAGE圖譜中則幾乎沒有明顯的蛋白條帶(圖2-B，泳道1)。這說明硫酸-鎢酸鈉沉淀法對4種蜂蜜尤其是棗花蜜中蛋白質的分離效果差于超濾法。

A-超濾法提取蜂蜜蛋白，B-硫酸-鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白；其中泳道M為Marker，泳道1-6分別為棗花蜜、荊條蜜、龍眼蜜、土蜂蜜、洋槐蜜和油菜蜜圖2 不同方法提取蜂蜜蛋白質SDS-PAGE圖譜Fig.2 The SDS-PAGE profiles of honey protein obtained by different extraction methods

棗花蜜pH在7左右接近中性，而其他5種蜂蜜呈酸性(pH 3～4)，蜂蜜體系酸堿性的差異可能導致硫酸-鎢酸鈉沉淀法不適用于提取棗花蜜蛋白[25]。CHUA等采用超濾法、鎢酸鈉沉淀法、硫酸銨鹽析法分離馬來西亞洋槐蜜、圖朗蜜和吉蘭蜂蜜蛋白質時，同樣發(fā)現(xiàn)超濾法對3種蜂蜜蛋白質的提取效果更佳[21]。然而，對于土蜂蜜，鎢酸鈉沉淀法提取蛋白雖然沒有超濾法濃度高，但其包含的蛋白質分布于泳道各個分子質量段，尤其有效富集了>97.4 kDa的高分子質量蛋白質(圖2-B，泳道4)；對于龍眼蜜，鎢酸鈉沉淀法獲得的蛋白質無論從種類還是含量方面，均明顯優(yōu)于超濾法(圖2-B，泳道3)。

由此可見，超濾法和硫酸-鎢酸鈉沉淀法對6種不同花源中國蜂蜜的蛋白質提取效果差異明顯，超濾法適合用來提取棗花蜜、荊條蜜、洋槐蜜和油菜蜜中蛋白質，而土蜂蜜和龍眼蜜則更適合用鎢酸鈉沉淀法進行。

2.4 不同花源蜂蜜提取蛋白RP-HPLC分析

反相高效液相色譜利用待分離物質的極性差異進行分離，可根據(jù)出峰時間分析組分的疏水特性。圖3-A和3-B分別是超濾法和鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白的RP-HPLC分析圖譜，可以看出，2種方法獲得的6種蜂蜜蛋白在RP-HPLC圖譜中顯示出明顯的組成和疏水特性差異。

A-超濾法提取蜂蜜蛋白；B-硫酸-鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白圖3 不同方法提取蜂蜜蛋白質RP-HPLC圖譜Fig.3 The RP-HPLC profiles of honey protein obtained by different extraction methods

采用超濾法提取的6種蜂蜜蛋白，其色譜峰主要集中在22～26 min，但峰形和峰高在蜂蜜品種間差異明顯，這預示著6種蜂蜜蛋白質中主要組分在極性上比較接近，但其種類和含量差異較大(圖3-A)。另外，土蜂蜜和荊條蜜分別在洗脫時間10 min和6 min出現(xiàn)1個明顯色譜峰，這說明這2種蜂蜜蛋白中包含特有的強親水性組分；而對于棗花蜜，10～21 min存在非常多的小色譜峰，這預示著超濾法提取棗花蜜蛋白包含多個極性差異較大的微量組分(圖3-A)。

從硫酸-鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白RP-HPLC圖譜上可以看出(圖3-B)，土蜂蜜尤其龍眼蜜在23～26 min 出現(xiàn)比較明顯的蛋白峰，并且5～20 min也存在一些小色譜峰，這從另一角度說明硫酸-鎢酸鈉沉淀法可以分離出更多種類的土蜂蜜和龍眼蜜蛋白質，與電泳結果相吻合；而對于棗花蜜、荊條蜜、油菜蜜和洋槐蜜，與超濾法相比，鎢酸鈉沉淀法提取蛋白RP-HPLC圖譜不僅在峰形上差異較大，而且峰面積很小(圖3-B)，這說明鎢酸鈉沉淀法獲得的蜂蜜蛋白在種類和含量上均很少，不適合用于此4種蜂蜜蛋白質的分離。

3 結論

本文研究了中國特色棗花蜜、荊條蜜、龍眼蜜、土蜂蜜、洋槐蜜和油菜蜜蛋白質電泳行為的差異，以及不同蛋白質提取方法對6種蜂蜜蛋白的分離效果。結果表明，6種不同花源蜂蜜表現(xiàn)出明顯的蛋白質電泳行為差異，其蛋白條帶遍布于14.4～97.4 kDa，但蛋白質組成和含量在蜂蜜品種間差異明顯，且僅部分品種在> 97.4 kDa存在較多高分子質量蛋白；采用超濾法和硫酸-鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白質時，超濾法適合于棗花蜜、荊條蜜、洋槐蜜和油菜蜜，而硫酸-鎢酸鈉沉淀法則適合于土蜂蜜和龍眼蜜，并且2種方法獲得的, 6種蜂蜜蛋白在SDS-PAGE和RP-HPLC圖譜中表現(xiàn)出明顯的分子質量大小和疏水特性差異。