Burkholderia cepacia中具有解脂作用的膽固醇酯酶的酶學(xué)特性

孫柳青，吳夢棋，張玲，武迪，辛瑜，楊海麟

(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

膽固醇酯酶(EC 3.1.1.13 cholesterol esterase，CHE)也被稱為甾醇酯酶，可以在水相中催化膽固醇酯的水解，轉(zhuǎn)化為膽固醇與脂肪酸，也可以在有機溶劑的存在下進行酯化與轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，其廣泛存在于哺乳動物與微生物中。哺乳動物來源的CHE屬于胞內(nèi)酶，主要存在于胰臟、血液、肝臟、腎臟等細胞中[1]。1976年UWAJIMA等首次報道分離出1株產(chǎn)CHE的熒光假單胞菌[2]，之后更多微生物來源的CHE被發(fā)現(xiàn)，如鏈霉菌屬、酵母菌屬、金黃色葡萄球菌等[3]。CHE在食品[4]、診斷試劑[5]、污水處理[6]、制漿造紙工業(yè)[7]、織物脫脂等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。

CHE屬于α/β水解酶家族中的酯類水解酶(EC 3.1.1.X，lipolytic enzyme)，該類酶中還包括了脂肪酶(EC 3.1.1.3 triacylglycerol hydrolase，lipase)[8-9]。CHE和脂肪酶結(jié)構(gòu)上有很明顯的差異，脂肪酶的活性中心被“蓋子(lid)”結(jié)構(gòu)包住，而部分CHE中會有固定在N-末端的“帽子(cap)”結(jié)構(gòu)[10]；這兩類酶最大的區(qū)別在其水解底物種類的不同，脂肪酶主要作用于長鏈脂肪酸形成的酯鍵，CHE主要作用于短鏈脂肪酸形成的酯鍵，而少部分CHE也可以水解脂肪酶的底物[11]。

在制漿造紙、皮革脫脂或污水處理等含有多種酯類或甘油三酯類物質(zhì)的環(huán)境，要求CHE具有良好的耐受性與廣泛的底物譜。本課題組在克拉瑪依油田油污染嚴(yán)重的土壤中篩得1株對高溫與有機溶劑耐受性較好的菌株，經(jīng)鑒定為洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)，保藏號為CCTCC M2017661，在其發(fā)酵液中檢測到明顯的CHE的活性。本文探討了所產(chǎn)CHE(以下簡稱CHEBur)對溫度、有機溶劑及表面活性劑的耐受性，并重點研究了該酶的膽固醇酯酶活性及其解脂能力(可水解對硝基苯酯類底物和三?；视王ヮ惖孜锏哪芰?，期望能為工業(yè)領(lǐng)域提供一種具有優(yōu)良特性的膽固醇酯酶，并為其工業(yè)應(yīng)用提供參考與借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 生產(chǎn)菌株

BurkholderiacepaciaZWS15由實驗前期篩選得到，并成功保藏在武漢大學(xué)菌種保藏中心，保藏號為CCTCC M2017661。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基，g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10；

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，K2HPO4·3H2O 2，KCl 0.5，葡萄糖 0.1，卵磷脂0.6，MgSO410 mmol/L。

1.1.3 試劑

膽固醇油酸酯、膽固醇亞油酸酯、膽固醇苯甲酸酯、膽固醇辛酸酯、對硝基苯乙酸酯和對硝基苯棕櫚酸酯：梯希愛公司；三丁酸甘油酯：上海麥克林生化科技有限公司；膽固醇氧化酶、辣根過氧化物酶：藍園酶制劑公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)及發(fā)酵

挑取BurkholderiacepaciaZWS15單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基37 ℃過夜培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的種子液按5%(體積分數(shù))接種到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)24 h。

1.2.2 酶活測定方法

1.2.2.1 膽固醇酯酶酶活測定方法

膽固醇酯酶酶活測定方法參考文獻[12]，反應(yīng)體系由0.11 mol/L磷酸鉀緩沖液、0.2 mmol/L膽固醇亞油酸酯、1.5 mmol/L 4-氨基安替吡啉、22 mmol/L苯酚、10 U/mL膽固醇氧化酶(cholesterol oxidase,COD)、5.1 U/mL辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, POD)組成，反應(yīng)在37 ℃下進行，于500 nm下測定3～4 min的變化值，繪制成曲線后計算線性部分每分鐘OD變化值，如公式(1)：

酶活/(U·mL-1)=

ΔOD/min×4.282×df

(1)

式中:△ODtest、△ODblank表示樣品與空白在500 nm下的吸光值；OD/min表示每分鐘內(nèi)OD的變化值；Vt表示反應(yīng)體系總體積，2.95 mL；Vs表示樣品體積，0.1 mL；df表示稀釋倍數(shù)。

1.2.2.2 解脂能力測定方法

采用脂肪酶的測定方法分析解脂能力，選取三酰基甘油酯和對硝基苯酯為底物。具體方法參考文獻[13]。

1.2.3 膽固醇酯酶的純化

取BurkholderiacepaciaZWS15發(fā)酵液在4 ℃、8 000 r/min離心5 min取上清，即得粗酶液；(NH4)2SO4沉淀后，重溶于50 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.5)中，并用相同的緩沖溶液透析過夜；使用pH 7.5、50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液平衡DEAE離子交換柱，上樣后用含有1 mol/L NaCl的同樣緩沖液以1 mL/min 的流速進行線性洗脫，對紫外檢測到的峰值進行收集。

1.2.4 蛋白濃度的測定及聚丙烯酰胺凝膠電泳

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，參考Bradford的方法測定蛋白質(zhì)濃度。

SDS-PAGE凝膠電泳采用5%的濃縮膠與12%的分離膠，具體配置方法參照索萊寶SDS-PAGE試劑盒。

1.2.5 飛行時間質(zhì)譜分析

切下SDS-PAGE中需要驗證的目的條帶，使用MALDI-TOF/TOF(matrix-assisted laserdesorption/ionization time of flight mass spectrometry)基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀，根據(jù)文獻[13]中所述方法，測定目的條帶中肽段質(zhì)量，將結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中已有序列進行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 B. cepacia胞外膽固醇酯酶的分離提取

B.cepacia在葡萄糖作為唯一碳源、卵磷脂作為誘導(dǎo)物的液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，獲得的發(fā)酵液在4 ℃、8 000 r/min離心5 min，取上清即為所需的粗酶液。使用飽和度為70%的(NH4)2SO4沉淀粗酶液，過夜透析， DEAE離子層析，結(jié)果如表1所示，得到比酶活為32.94 U/mg的純酶，純化倍數(shù)為39倍，回收率為17.78%。

收集純化各步樣品進行SDS-PAGE蛋白電泳分析，結(jié)果如圖1所示，獲得單一的條帶，SDS-PAGE檢測表明該純酶分子質(zhì)量約為37 kDa。

表1 B. cepacia膽固醇酯酶的各步純化分析Table 1 Purification of cholesterol esterase from Burkholderia cepacia

M-marker;1-發(fā)酵粗酶液;2-70%(NH4)2SO4沉淀;3-透析24 h;4-DEAE陰離子交換層析圖1 膽固醇酯酶各步純化的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE of B. cepacia cholesterol esterase after purification

2.2 B. cepacia膽固醇酯酶的酶學(xué)性質(zhì)測定

2.2.1 膽固醇酯酶的最適pH和pH穩(wěn)定性分析

在不同的pH緩沖溶液中，于37 ℃測定CHEBur降解膽固醇油酸酯的殘留酶活，用于稀釋酶液的緩沖液體系包括：0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH 3.0～5.5)、 0.2 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 5.5～7.5)、0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5～9.0)、0.2 mol/L Na2CO3-NaHCO3(pH 9.0～11.0)、0.2 mol/L NaOH-NaCl(pH 11.0～12.0)。純化后CHEBur的pH穩(wěn)定性和最適pH在圖2中呈現(xiàn)。CHEBur在pH 5.5～9.0 保持穩(wěn)定(圖2-a)。放置16 h后，酶活最大殘留率出現(xiàn)在pH值為8.0的條件下。該酶的最適反應(yīng)pH值在7.5 ～9.0(圖2-b)。

a-膽固醇酯酶的pH穩(wěn)定性(在25 ℃、不同pH條件下溫育16 h)；b-膽固醇酯酶的最適反應(yīng)pH圖2 pH對膽固醇酯酶活性及穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of pH on activity and stability of B. cepacia cholesterol esterase

2.2.2 膽固醇酯酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性分析

以膽固醇油酸酯為底物，在pH 7.0、0.2 mol/L磷酸鹽緩沖體系中，不同溫度下測定殘留的膽固醇酯酶活性。CHEBur在20～60 ℃維持穩(wěn)定，放置2 h能保留90%以上的酶活，具有顯著的耐熱性(圖3-a)。該酶在pH 7.0的條件下最適反應(yīng)溫度為40 ℃(圖3-b)。

a-膽固醇酯酶的溫度穩(wěn)定性(使用pH 7.0、0.2 mol/L的磷酸鉀緩沖液稀釋酶液，不同的溫度條件下溫育2 h); b-膽固醇酯酶的最適反應(yīng)溫度圖3 溫度對膽固醇酯酶活性及穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of temperature on activity and stability of B. cepacia cholesterol esterase

目前已報道的CHE最適反應(yīng)溫度大部分都在37～45 ℃，與本文實驗測得數(shù)值相似。BurkholderiacepaciaST-200來源[14]的CHE，在65 ℃溫育30 min保留95%以上酶活，而在70 ℃酶活殘留率僅為10%左右。本文CHEBur在70 ℃溫育2 h后，酶活殘留率維持在70%以上，具有更好的溫度耐受性。

2.2.3 表面活性劑對B.cepacia膽固醇酯酶穩(wěn)定性的影響

工業(yè)生產(chǎn)中會考慮加入一些表面活性劑去除難除去的雜質(zhì)，但同時表面活性劑會引起酶構(gòu)象的改變，影響酶的活性，要求酶蛋白具有一定的表面活性劑耐受性[15]。本實驗選取常用的吐溫類表面活性劑和曲拉通研究CHEBur穩(wěn)定性，結(jié)果如表2所示，實驗均進行3次平行。

將酶液與不同的表面活性劑混合置于37 ℃下1 h后，使用膽固醇油酸酯作為底物測定混合后殘留的酶活。實驗組的殘留酶活均大于對照組，添加適量的表面活性劑能夠明顯的促進CHEBur對底物的水解作用。當(dāng)體系中含有5%(體積分數(shù))的表面活性劑時，與對照組相比，曲拉通X-100、吐溫60和吐溫80處理過的CHEBur仍能維持1倍以上的酶活，曲拉通X-100對CHEBur的激活作用最為明顯。

2.2.4 有機溶劑對B.cepacia膽固醇酯酶穩(wěn)定性的影響

污水處理、制漿造紙和皮革織物脫脂處理中不僅可能存在會影響酶活性的表面活性劑，大多還含有高濃度的有機溶劑[16]?？疾斐Ｓ糜袡C溶劑對CHEBur酶活的影響很有必要本實驗選用了5種親水性有機溶劑及11種疏水性有機溶劑，分別測定了其與CHEBur混合后酶活的變化(結(jié)果未列)，選擇其中CHEBur較耐受的9種有機溶劑，考察不同的體積分數(shù)(0、15%、30%、50%)有機溶劑對CHEBur水解膽固醇油酸酯穩(wěn)定性的影響(表3)。

表2 不同濃度的表面活性劑對B. cepacia膽固醇酯相對酶活性的影響Table 2 Effects of detergent contents on the activity of B. cepacia cholesterol esterases

注：*為混合體系中不同種類表面活性劑的體積分數(shù)。所有數(shù)據(jù)取3次實驗平均值。下同。

相較于未添加有機溶劑的組，體系中含有15%(體積分數(shù))的有機溶劑能提高CHEBur相對酶活≥2倍，石油醚甚至能達到2.5倍左右。在50%有機溶劑存在下，僅DMSO、甲苯和正辛烷出現(xiàn)減弱現(xiàn)象，酶活殘留率維持在1倍左右，其余試劑仍能激活酶的水解能力，且乙醇和環(huán)己烷能達到1.25和1.21倍的效果?？梢娫撁笇τ袡C溶劑有較強耐受性，與對照組相比，在50%(體積分數(shù))有機溶劑存在下仍然具有較高酶活。

表3 不同濃度的有機溶劑對B. cepacia膽固醇酯酶活性的影響Table 3 Effects of organic solvents on the activity of B. cepacia cholesterol esterases

注：*為混合體系中不同種類有機溶劑的體積分數(shù)；親水對照使用1 mL、pH 7.0、0.2 mol/L的磷酸鉀緩沖液稀釋2 mL CHEBur，疏水對照為2 mL CHEBur，樣品使用1 mL有機溶劑與2 mL CHEBur混合。

2.3 B. cepacia膽固醇酯酶的肽譜分析

將SDS-PAGE上的單一條帶切割用于飛行時間質(zhì)譜鑒定，確定該蛋白的分子質(zhì)量及具體信息。MALDI-TOF的結(jié)果如圖4所示，經(jīng)過系統(tǒng)比對得到匹配度較高的兩個蛋白分別為三?；视椭久?lipase)與膽固醇酯酶(cholesterol esterase)。

圖4 純化后膽固醇酯酶的飛行時間質(zhì)譜結(jié)果Fig.4 Flight mass spectrometry identification of B. cepacia cholesterol esterase after purification

其中l(wèi)ipase來源于Pseudomonassp. KWI-56，GenBank號為P25275，分子質(zhì)量為37 659 Da，有4個肽段與樣品完全重合；膽固醇酯酶來源于Burkholderiacepacia，GenBank號為BAD13379，分子質(zhì)量為37 737 Da，與lipase一樣有4個肽段與樣品完全重合。根據(jù)GenBank號在NCBI中獲得全部的序列，經(jīng)過DNAMAN比對后，發(fā)現(xiàn)CHEBur與兩種蛋白同源性高達90%以上。根據(jù)以上兩個匹配度較高的蛋白分類，推測該CHEBur可能同時具有膽固醇酯酶特性和解脂特性。

2.4 膽固醇酯酶與商品化酶的酯酶活性和解脂能力的比較分析

CHE通常以膽固醇酯類物質(zhì)為底物，解脂作用通常以三酰基甘油酯類和對硝基苯酯類為底物。為了研究該酶的酯酶特性和解脂特性，本實驗選用CHEBur與3種商品化酶(藍園Pseudomonassp. CHE、天野微生物來源的lipase和動物胰臟源的lipase)，重點比較它們的膽固醇酯酶活性和解脂能力。按照1.2.2 的方法測定各活性，進行3次平行實驗，結(jié)果列舉在表4中。

考察膽固醇酯酶活性，選取4種膽固醇酯類底物，水解能力高低為：膽固醇油酸酯(18∶1)>膽固醇亞油酸酯(18∶2)>膽固醇苯甲酸酯>膽固醇辛酯(8∶0)， 對膽固醇油酸酯的活性最高，達到1 038 U/L，該底物?；鶜埢鶠?8∶1，膽固醇辛酸酯的活性最低，僅有294 U/L，膽固醇辛酸酯的酰基殘基為8∶0，可以看出CHEBur在水解選用的幾種底物時，對長鏈膽固醇酯類底物水解能力最強。

表4 B. cepacia膽固醇酯酶對不同底物的水解能力及與商品化酶的比較Table 4 Hydrolysis ability of B. cepacia cholesterol esterase with different substrate and comparison with commercial enzymes

注：a為本實驗發(fā)酵得到的膽固醇酯酶，分子質(zhì)量為37 kDa；b為來源于Pseudomonassp.的膽固醇酯酶，分子質(zhì)量為300 kDa?！?”表示沒有檢出。

考察解脂能力，選取三?；视王ヮ惖孜锖蛯ο趸锦ヮ惖孜飦肀碚鳌HEBur水解三?；视王ヮ惖孜锏捻樞驗椋洪蠙煊?18∶1)>三油酸甘油酯(18∶0)>三丁酸甘油酯(4∶0)。CHEBur水解對硝基苯酯類底物的順序為：對硝基棕櫚酸酯(16∶0)>對硝基乙酸酯(2∶0)。說明CHEBur同樣對長鏈三?；视王ヮ惖孜锖蛯ο趸锦ヮ惖孜锼饽芰ψ顝?。

綜上所述，B.cepacia所產(chǎn)CHE既能降解膽固醇酯類底物，也具有解脂活性。

3 結(jié)論

本文以課題組篩得的BurkholderiacepaciaZWS15(保藏號為CCTCC M2017661)所產(chǎn)CHE為研究對象，在(NH4)2SO4沉淀和DEAE離子交換后獲得分子質(zhì)量為37 kDa的純酶，該酶比酶活為32.94 U/mg，純化倍數(shù)為39倍。該酶的最適反應(yīng)pH為7.5～9.0，在pH 5.5～9.0保持穩(wěn)定；最適反應(yīng)溫度為40 ℃, 70 ℃溫育2 h后仍能保留70%以上的酶活，具有顯著的耐熱性；該酶還具有良好的表面活性劑與有機溶劑耐受性，5%表面活性劑(吐溫60、吐溫80和曲拉通X-100)和50%有機溶劑(DMSO、甲醇、乙醇、石油醚、苯、甲苯、環(huán)己烷、正己烷和正辛烷)對其具有一定的酶活作用。經(jīng)過飛行時間質(zhì)譜的肽段同源性比對分析及底物水解實驗，確定該酶屬于具有解脂作用的膽固醇酯酶，既有膽固醇酯酶活性，又有解脂能力，且對長鏈底物具有明顯的偏好性。該酶的優(yōu)良性能可為食品、臨床診斷、污水處理、制漿造紙工業(yè)、織物脫脂等提供新型的酶制劑，具有很大的商業(yè)價值。