腹瀉仔豬與健康仔豬糞便菌群多樣性的比較

汪 群，閆 鶴

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510641）

腹瀉是仔豬最常發(fā)的疾病之一，由于其高發(fā)病率與高死亡率，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。引發(fā)仔豬腹瀉的病原有多種，其中大腸桿菌，特別是產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC），是仔豬腹瀉的重要病原之一[2]。另外，腸道微生物失衡也是導(dǎo)致仔豬腹瀉的一個(gè)重要因素[3]。腹瀉發(fā)生時(shí)，病原微生物的定植急劇增加，仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡[4]。分析腹瀉仔豬與健康仔豬的腸道微生物差異，有助于早期診斷和預(yù)防腹瀉。

哺乳仔豬腸道環(huán)境和免疫系統(tǒng)還不穩(wěn)定和成熟，對(duì)病原微生物特別敏感，因此很容易受到感染而發(fā)生腹瀉。目前對(duì)仔豬腸道菌群的研究主要集中在對(duì)不同年齡的縱向比較或斷奶前后的飲食變化[5-7]，而對(duì)腹瀉與健康仔豬腸道菌群的差異的報(bào)道較少。Hermann-Bank 等[3]研究表明，與健康仔豬相比，新生腹瀉仔豬腸道放線菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度減少，而腸球菌和大腸桿菌的相對(duì)豐度增加。

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，采用16S rRNA 高通量測(cè)序的方法研究腸道菌群已成為熱點(diǎn)。本研究通過(guò)對(duì)16 頭腹瀉和健康哺乳仔豬的糞便樣本進(jìn)行16S rRNA 測(cè)序，比較腹瀉與健康哺乳仔豬的糞便菌群的結(jié)構(gòu)差異，探究與仔豬腹瀉相關(guān)的微生物病原，為腹瀉仔豬的治療提供依據(jù)和預(yù)防策略。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 從廣東某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)中采集15 日齡健康和腹瀉仔豬糞便樣品各8 份。腹瀉仔豬表現(xiàn)為水樣腹瀉，糞稀，呈灰黃色，利用滅菌醫(yī)用棉簽蘸取肛門處糞便樣品。健康仔豬同樣采用滅菌醫(yī)用棉簽收集2～3 粒糞便樣品。所有樣品經(jīng)干冰運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存。

1.2 樣品總DNA 提取 所有糞便樣品均采用QIAamp stool DNA Mini kit（Qiagen,U.S.）提取樣品總DNA，具體操作嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行。利用NanoDrop 2000 檢測(cè)DNA 濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量。DNA 于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 16S rRNA 基因擴(kuò)增 選擇16S rRNA 基因的V3-V4 區(qū)作為擴(kuò)增和測(cè)序的目的區(qū)間。引物序列：338F：5'-ACTC CTACGGGAGGCAGCAG-3'；806R：5'-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′。反應(yīng)體系：4 μL 5× FastPfu Buffer，2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.8 μL Forward Primer（5.0 μmol/L），0.8 μL Reverse Primer（5.0 μmol/L），0.4 μL FastPfu Polymerase，10 ng DNA 模板，補(bǔ)足去離子水至20 μL。PCR 儀為ABI GeneAmp?9700 型，擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min，27 個(gè)循環(huán)（95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），72℃延伸10 min。

1.4 Illumina Miseq 測(cè) 序 使 用AxyPrep DNA 凝 膠 回收試劑盒（Axygen 公司）回收PCR 產(chǎn)物，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，再用QuantiFluor?-ST（Promega，USA）檢測(cè)定量。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)Illumina MiSeq 平臺(tái)（Illumina，USA）進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300 文庫(kù)（上海美吉）。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 原始測(cè)序序列使用Trimmomatic 和FLASH軟件進(jìn)行過(guò)濾和拼接。使用UPARSE 軟件，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU 聚類。利用UCHIME 軟件剔除嵌合體，采用RDP classifier 貝葉斯算法（置信度閾值為0.7）對(duì)97%相似水平的OTU 代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在界、門、綱、目、科、屬、種7 個(gè)水平上統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成。選擇Silva（Release 123 http://www.arb-silva.de）作為參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)。使用Mothur 軟件計(jì)算樣本alpha 多樣性指數(shù)，采用Sobs、Ace、Chao、Simpson、Shannon 和Coverage 評(píng)估指數(shù)分別對(duì)樣本進(jìn)行alpha 多樣性分析?；贐ray-Curtis 算法計(jì)算樣本間距離，并根據(jù)該距離對(duì)樣本進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）。物種差異分析采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)方法，確定2 組糞便菌群中具有顯著性差異的物種。

2 結(jié) 果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)整體分析 16 份糞便樣本經(jīng)測(cè)序后共得到858 444 條有效序列數(shù)，序列平均長(zhǎng)度為454.14 bp，最小樣本序列數(shù)為31 379 bp。對(duì)OTU 原始序列按最小樣本序列數(shù)進(jìn)行抽平，后續(xù)的所有分析均以抽平后的序列為基礎(chǔ)進(jìn)行聚類分析。通過(guò)同源性序列比對(duì)及聚類相結(jié)合的方法，所有序列共有20 個(gè)門、38 個(gè)綱、65 個(gè)目、121 個(gè)科、271 個(gè)屬和694 個(gè)OTU。

2 組樣本群落覆蓋度超過(guò)99%，表明所有樣本的測(cè)序深度足夠，可以反映樣本的微生物信息。表1 中Shannon 和Simpson 指數(shù)表明健康組仔豬糞便菌群的多樣性高于腹瀉組（P＜0.05）。Sobs、Ace 和Chao 指數(shù)表明健康組仔豬糞便菌群的豐富度高于腹瀉組，但2 組間差異不顯著。

表1 兩組樣本alpha 多樣性

PCoA 分析用于比較腹瀉和健康仔豬兩組的群落結(jié)構(gòu)。主坐標(biāo)成分（PC1、PC2 和PC3）占有86.34% 的樣本組成差異，表明健康和腹瀉狀態(tài)下樣本的微生物群落組成是可以相互區(qū)分的，且仔豬腹瀉后糞便菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變（圖1）。

圖1 Beta 多樣性分析（OTU 水平的糞便菌群PCoA 分析）

2.2 糞便菌群組成結(jié)構(gòu)分析 在門的分類水平上，腹瀉組仔豬糞便菌群的分類數(shù)為16 個(gè)，其中變形菌門（Proteobacteria，53.62%）和厚壁菌門（Firmicutes，44.26%）是優(yōu)勢(shì)菌，約占總細(xì)菌的98%。健康組仔豬糞便中共有13 個(gè)菌門，其中厚壁菌門（56.24%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，26.92%）和變形菌門（9.42%）是優(yōu)勢(shì)菌（圖2-A）。

在屬的分類水平上，腹瀉組和健康組仔豬糞便菌群的分類數(shù)分別是483 個(gè)和453 個(gè)，其中2 組共有的菌屬是242 個(gè)，占總菌屬的34.87%。腹瀉組仔豬糞便中相對(duì)豐度較高的細(xì)菌依次是埃希氏- 志賀菌 屬（Escherichia-Shigella，44.49%）、 乳 桿 菌 屬（Lactobacillus，37.32%）、布魯氏菌科未分類的屬（unclassified_Brucellaceae，3.77%）和克雷伯氏菌屬（Klebsiella，3.59%）（圖2-B）。健康組中相對(duì)豐度較高的菌屬則依次為擬桿菌屬（Bacteroides，13.39%）、Lachnoclostridium（9.82%）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus，5.66%）、埃希氏-志賀菌屬（5.15%）、梭菌屬（Clostridium，4.51%）和乳桿菌屬（3.73%）等（圖2-B）。

圖2 2 組樣本在門水平（A）和屬水平（B）上的糞便菌群組成結(jié)構(gòu)

2.3 糞便菌群物種差異分析 在門的分類水平上，腹瀉組與健康組之間有明顯差異的菌門有4 種。與健康組比較，腹瀉仔豬糞便中變形菌門的相對(duì)豐度顯著增加，擬桿菌門的相對(duì)豐度顯著降低（圖3-A）。在屬的分類水平上，在排名前15 的菌屬中，腹瀉組與健康組仔豬之間有明顯差異的菌屬有13 種。相較于健康仔豬，腹瀉組仔豬相對(duì)豐度明顯升高的菌屬依次是埃希氏-志賀菌屬、乳桿菌屬、克雷伯氏菌屬和布魯氏菌科未分類的屬，明顯降低的是擬桿菌屬、Lachnoclostridium 和瘤胃球菌屬等（圖3-B）。

圖3 2 組樣本在門水平（A）和屬水平（B）上的物種差異分析

3 討 論

動(dòng)物腸道內(nèi)有大量微生物，相對(duì)穩(wěn)定的腸道菌群使腸道具有抵抗病原微生物入侵的作用[8]。本研究采用16S rRNA 高通量測(cè)序的方法全面評(píng)估哺乳仔豬糞便菌群，發(fā)現(xiàn)腹瀉仔豬糞便菌群多樣性低于健康仔豬。Hermann-Bank 等[3]發(fā)現(xiàn)腹瀉仔豬菌群多樣性低于健康仔豬。類似的，Pop 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，腹瀉兒童的糞便菌群多樣性低于健康兒童。本研究發(fā)現(xiàn)腹瀉仔豬糞便菌群多樣性較健康仔豬顯著減少，推測(cè)腹瀉可能是仔豬糞便菌群失衡的重要因素。

本試驗(yàn)中，健康仔豬糞便菌群中的優(yōu)勢(shì)菌主要是厚壁菌門（56.24%）、擬桿菌門（26.92%）和變形菌門（9.42%），與Chen 等[10]研究一致，即厚壁菌門和擬桿菌門是健康哺乳仔豬腸道中豐度最高的菌門。仔豬腹瀉后，其糞便菌群中變形菌門的相對(duì)豐度顯著增加，而擬桿菌門顯著減少。變形菌門包括很多病原體，如埃希氏菌屬、沙門氏菌屬和螺桿菌屬。有研究表明，致病性大腸桿菌是仔豬腹瀉的重要病原菌，其中ETEC 能黏附并產(chǎn)生腸毒素作用于小腸上皮細(xì)胞，導(dǎo)致水和電解質(zhì)分泌過(guò)多，重吸收減少而導(dǎo)致腹瀉[11]。本研究中，腹瀉仔豬主要是埃希氏-志賀菌屬的相對(duì)豐度顯著增加，是健康組仔豬的9 倍，表明埃希氏-志賀菌屬可能是本次仔豬腹瀉發(fā)生的潛在致病菌，為下一步研究與腹瀉相關(guān)的菌群及微生物學(xué)機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)。另外，擬桿菌屬、Lachnoclostridium 和瘤胃球菌屬主要參與碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝以及維持腸道正常的生理功能，這些有益菌數(shù)量在腹瀉仔豬糞便中的相對(duì)豐度顯著減少，使腸道對(duì)碳水化合物的消化吸收和代謝能力減弱，可能與腹瀉發(fā)生相關(guān)[12]。

厚壁菌門是所有被檢測(cè)仔豬糞便中的優(yōu)勢(shì)菌，可產(chǎn)短鏈脂肪酸和調(diào)節(jié)系統(tǒng)免疫反應(yīng)。乳桿菌屬于厚壁菌門，具有維持腸道正常菌群、抑制病原體粘附小腸壁和防止炎癥發(fā)生等作用，然而具體的作用機(jī)制目前還不清楚[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬在腹瀉仔豬中的相對(duì)豐度顯著高于健康仔豬（10 倍），主要包括食淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylovorus）和約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）。食淀粉乳桿菌在仔豬腸道分布很廣泛，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子抑制病原菌粘附小腸壁和保護(hù)膜屏障，減輕由ETEC 引起的仔豬腹瀉[14]。約氏乳桿菌參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-12 的產(chǎn)生，保護(hù)腸黏膜屏障，抑制大腸桿菌的附著[15]。本試驗(yàn)表明，乳桿菌屬可能在由致病性大腸桿菌引起的仔豬腹瀉中起到保護(hù)作用，然而還需進(jìn)一步對(duì)仔豬的代謝產(chǎn)物等進(jìn)行研究，探究乳桿菌屬與仔豬腹瀉的相互關(guān)系。

Yang 等[16]比較新生腹瀉仔豬與健康仔豬的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)腹瀉仔豬腸道大腸桿菌和乳桿菌屬的相對(duì)豐度都減小，與本試驗(yàn)結(jié)果存在一定的差異，可能與仔豬的年齡、遺傳背景以及飼養(yǎng)環(huán)境等因素有關(guān)。

綜上所述，本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了腹瀉仔豬與健康仔豬糞便菌群的差異，其中某些菌群特異性的增加或減少可作為評(píng)價(jià)仔豬腹瀉的參考指標(biāo)，為哺乳仔豬腹瀉的治療及預(yù)防提供依據(jù)。