牛性控精液純度快速評價方法研究

侯勝奎，陶晨雨，胡慧艷，劉 津，李志強(qiáng)，張 婧，賈 青,2,3*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定 071000；2.國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北保定 071000；3.河北省山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北保定 071000）

性別預(yù)選在動物生產(chǎn)行業(yè)中起著重要的經(jīng)濟(jì)作用，如奶牛行業(yè)更需要母牛，而肉牛行業(yè)則需要公牛[1]。精液中X（雌性）或Y（雄性）精子的分離是一種流行的性別選擇方法。目前已經(jīng)開發(fā)出幾種精子分選技術(shù)：基于精子不同免疫學(xué)特性進(jìn)行精子的分選[2-4]，根據(jù)X、Y 精子不同的游泳能力進(jìn)行精子分選[5]，細(xì)胞分離液微分離差異[6]和白蛋白梯度的差異分離等[6-7]精子分選技術(shù)。采用流式細(xì)胞術(shù)分離X、Y 精子被認(rèn)為是最可靠、有效的方法，可獲得純度大于90%的理想性別精子[8-11]。目前檢測分選精液純度的常用方法為流式細(xì)胞儀重分析法和多色熒光原位雜交技術(shù)，利用流式細(xì)胞儀重分析法檢測時若物種X、Y 精子DNA 含量低于3%，會影響其檢測準(zhǔn)確性；多色熒光原位雜交技術(shù)復(fù)雜，耗時并且需要高技能的技術(shù)人員，限制了其應(yīng)用[12-15]。因此，建立一種快捷、簡便、準(zhǔn)確性高的性控精液鑒定方法有重要使用價值及廣闊的應(yīng)用前景。

PLP 基因又被稱為蛋白質(zhì)脂蛋白基因，X 染色體特異基因，在胚胎發(fā)育早期的膠質(zhì)祖細(xì)胞中表達(dá)，并隨著胚胎發(fā)育成熟而增加[16-20]。Parati 等[21]利用PLP 基因采用探針法對性控精液進(jìn)行檢測，結(jié)果符合預(yù)期。SRY 為性別決定基因，被Sinclair 等[22]在哺乳動物性腺中發(fā)現(xiàn)。Koopman 等[23]將含有SRY 基因的DNA 片段（14 kb）移植到XX 染色體的雌鼠體內(nèi)，11 只轉(zhuǎn)基因XX 小鼠中有3 只成功實(shí)現(xiàn)性反轉(zhuǎn)成為雄性小鼠。本研究對牛X、Y 特有基因PLP、SRY 設(shè)計特異引物，構(gòu)建含有PLP和SRY 基因的質(zhì)粒，把PLP 和SRY 質(zhì)粒按照不同比例混合，即X:Y 分別為 1:20、1:10、1:5、1:1、5:1、10:1、20:1，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立檢測方法；并對購買的市售性控精液進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR 純度檢測，檢測結(jié)果與市售性控精液商標(biāo)標(biāo)注純度進(jìn)行對比，以驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，為今后開展動物性控精液精確檢測和性別控制進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 中國荷斯坦奶牛血液樣品由徐水縣漕河鎮(zhèn)徐水圣美奶牛專業(yè)合作社提供。中國荷斯坦奶牛性控精液購自內(nèi)蒙古賽科星繁育生物技術(shù)有限公司，商業(yè)精液來自3 頭公牛，牛號分別為15516051、15516055、15517034，每頭公牛提供X、Y 性別分選精液和未分選精液各4 支，15516051 號公牛X 分選精液商標(biāo)純度為90%，Y 分選精液商標(biāo)純度為92%，未分選精液商標(biāo)純度為50%；15516055 號公牛X 分選精液商標(biāo)純度為90%，Y 分選精液商標(biāo)純度為90%，未分選精液商標(biāo)純度為50%；15517034 號公牛X 分選精液商標(biāo)純度為92%，Y 分選精液商標(biāo)純度為90%，未分選精液商標(biāo)純度為50%。

1.2 主要試劑 血液、細(xì)胞、組織、基因組DNA 提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit（離心柱式）DP304購自天根生化科技（北京）有限公司，F(xiàn)ast Super EvaGreen?qPCR Master Mix 購 自U S EVRBRIGHT?INC，2×Es Taq MasterMix（Dye）、ddH2O、染料（GelStain）、瓊脂糖（Agarose）、100 bp DNA Ladder，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。特異引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.3 DNA 提取 牛血液DNA 和精液DNA 提取參考血液、細(xì)胞、組織、基因組DNA 提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit（離心柱式）DP304 說明書，將提取的DNA 放-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計與合成 從NCBI 數(shù)據(jù)庫中獲取牛PLP 基因和SRY 基因，下載基因序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計特異引物，引物序列見表1，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.5 PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系總體積50 μL：10×Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，Taq 酶0.5 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 37.5 μL。

PLP 基因PCR 反應(yīng)程序：94℃，5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 13 s，32 個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。1%凝膠電泳檢測擴(kuò)增條帶是否為目的條帶。SRY 基因PCR 反應(yīng)程序：94℃，5 min；94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 14 s，32 個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。1% 凝膠電泳檢測所擴(kuò)增條帶是否為目的條帶。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR 反應(yīng)程序及條件 實(shí)時熒光定量PCR 體 系 和 程 序 參 考Fast Super EvaGreen?qPCR Master Mix 試劑盒說明書。反應(yīng)體系：加入qPCR Mix 10 μL、Sense Primer 10 μmol/L 和Anti-sense Primer 10 μmol/L 均0.8 μL，DNA 樣品2 μL，加入ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)程序：采用三步法，94℃預(yù)變性30 s，94℃變性5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，設(shè)置40 個循環(huán)。

1.7 質(zhì)粒提取 取50 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化，具體操作步驟參考EasyPure PCR Purification Kit 試劑盒說明書。將純化產(chǎn)物-20℃保存。要求PCR 產(chǎn)物電泳條帶清晰，無雜帶，也無引物二聚體。對目的片段連接、轉(zhuǎn)化，進(jìn)行質(zhì)粒提取，提取過程按照SanPrep 柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒說明書進(jìn)行操作，質(zhì)粒需-20℃保存。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒拷貝數(shù)計算及構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒提取后，用NaNoDrop 2000 分光光度計測質(zhì)粒濃度和質(zhì)量、A260/280及A260/230，純度在1.8～2.0，可用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。質(zhì)粒拷貝數(shù)計算公式：質(zhì)?？截悢?shù)（copies/μL）=6.02×1023（copies/mol）×質(zhì)粒濃度（ng/μL）/質(zhì)粒分子量（g/mol）。用稀釋好的濃度為108拷貝至103拷貝的重組質(zhì)粒作為模板，每個梯度重復(fù)3 次，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。使用Fast Super EvaGreen?qPCR Master Mix 進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR 擴(kuò)增（反應(yīng)條件和程序同上）。

1.9 方法的建立 構(gòu)建2 個含有擴(kuò)增PLP 基因片段和SRY 序列的質(zhì)粒，并將其作為性別相關(guān)DNA 定量的參考模板，使用不同比例的PLP 和SRY 質(zhì)粒，即（X:Y分別為1:20、1:10、1:5、1:1、5:1、10:1、20:1，終濃度為100 fg 作為已知比率模板用來驗(yàn)證市售性控精液的方法。

1.10 市售性控精液的檢測 對市售的X、Y 性控精液與未分離精液進(jìn)行檢測（反應(yīng)條件和程序同上），使用已知DNA 參考模板構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)Ct 值與每種性別特異性DNA 模板拷貝數(shù)之間的關(guān)系。使用構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量市售精液與未分離精液每種性別特異性DNA，每個樣品中X 和Y 含量的總和等于100%，用來估計商業(yè)精液中X 精子含量（X%）和Y 精子含量（Y%）的百分比。

1.11 統(tǒng)計分析 根據(jù)拷貝數(shù)和Ct 值關(guān)系計算精液的表達(dá)量。表達(dá)差異采用SPSS19.0 的單因素方差分析，以P＜0.05 表示顯著差異，以P＞0.05 表示差異不顯著，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛PLP 基因和SRY 基因擴(kuò)增結(jié)果 使用母牛DNA樣本對牛X 染色體特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的凝膠電泳檢測，擴(kuò)增目標(biāo)帶大小為214 bp（圖1），與預(yù)期片段大小一致。使用公牛和母牛DNA 樣本同時對牛Y 染色體特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的凝膠電泳檢測，擴(kuò)增目標(biāo)帶大小為229 bp（圖2），與預(yù)期片段大小一致。

圖1 PLP 基因檢測結(jié)果

圖2 SRY 基因檢測結(jié)果

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果分析 通過對PLP、SRY 基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，每個質(zhì)粒模板3 個重復(fù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3 和圖4）顯示，起始模板與Ct 呈良好的線性關(guān)系，PLP、SRY 基因質(zhì)粒模板所建立的直線回歸的決定系數(shù)R2分別達(dá)到0.995 9 和0.996 8，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合度極高。

2.3 市售性控精液檢測結(jié)果 對市售的X、Y 性控精液與未分離精液進(jìn)行檢測，使用參考質(zhì)粒DNA 構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)Ct 值和DNA 模板拷貝數(shù)之間的關(guān)系，計算出市售的X、Y 性控精液與未分離精液的純度。如表3 所示，市售精液檢測純度與市售精液商標(biāo)標(biāo)注的純度差異不顯著。

圖3 PLP 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖4 SRY 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表3 商業(yè)精液樣品純度檢測

3 討 論

Rath 等[24]采用流式細(xì)胞儀對豬分選精液進(jìn)行二次分離，獲得X 分選精子純度為97%，為了證實(shí)X 分選精液的準(zhǔn)確性，對體外受精58 h 的胚胎移植到受體母豬輸卵管內(nèi)，并對其后代進(jìn)行性別跟蹤，結(jié)果顯示X分選精液后代母豬比例為97%，未分選精液公豬比例為52%，母豬比例為48%。Brien 等[25]對猩猩、狒狒、獼猴3 種動物精液進(jìn)行流式細(xì)胞儀分離，并對分離后的性控精液采用FISH 評價法和流式細(xì)胞儀重分析法再次檢測精液的純度，2 種方法所檢測的X 分選精液、Y 分選精液、未分離精液差異均不顯著。本研究采用實(shí)時熒光定量PCR 法對市售牛性控精液純度值進(jìn)行檢測，被檢測的X 分選精液、Y 分選精液、未分選精液3 種精液純度值與市售精液商標(biāo)標(biāo)注純度值差異不顯著；因購買的市售性控精液商標(biāo)標(biāo)注純度值是由流式細(xì)胞儀重分析法所得，當(dāng)動物X、Y 精子之間DNA 含量差異大于3%時，流式細(xì)胞儀重分析法比較準(zhǔn)確[26-27]，牛X、Y 精子DNA 含量差異為3.8%[28]，由此可見流式細(xì)胞儀重分析法所檢測的市售性控精液商標(biāo)標(biāo)注純度值比較準(zhǔn)確，同時，反映出實(shí)時熒光定量PCR 法可用于檢測性控精液的純度，經(jīng)實(shí)時熒光定量PCR 法對性控精液檢測，檢測結(jié)果與市售精液商標(biāo)標(biāo)注結(jié)果差異不顯著，表明實(shí)時熒光定量PCR 可用于動物性控精液純度檢測。

實(shí)時熒光定量PCR 相對于流式細(xì)胞儀重分析法有一定的優(yōu)勢，如某些動物X、Y 精子DNA 含量差異低于3%，流式細(xì)胞儀重分析法檢測結(jié)果準(zhǔn)確度比較低，目前，流式細(xì)胞儀分析法對牛精液分離效果最好[26-27]。而實(shí)時熒光定量PCR 檢測方法不會受到X、Y 精子DNA 含量差異的影響，再者，流式細(xì)胞儀價格比較昂貴，一般實(shí)驗(yàn)室很難配備，實(shí)時熒光定量PCR 檢測方法相對于流式細(xì)胞儀分離檢測，適用范圍廣，準(zhǔn)確度有保證，成本便宜[28]。采用實(shí)時熒光定量PCR 檢測性控精液的純度有一些注意事項(xiàng)：首先，在構(gòu)建DNA 參考模板時2 種質(zhì)粒比例一定要充分混勻，如果DNA 參考模板比例混合不均勻?qū)⒅苯佑绊憳悠窓z測的結(jié)果；再者，使用移液槍移取液體時一定要避免槍頭內(nèi)有殘留液體，否則會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性；采用實(shí)時熒光定量PCR 對性控精液純度進(jìn)行檢測，該檢測法需要特定的儀器，不能直接獲得精液純度，需要間接推測，從而影響了推廣應(yīng)用。實(shí)時熒光定量PCR 檢測方法要求操作者要有嫻熟的操作技巧，并且保證質(zhì)粒混合均勻，使用精密度比較高的移液槍，從而優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。雖然實(shí)時熒光定量PCR 仍存在不足之處，但這種檢測方法為動物性控精液、性別控制等技術(shù)研究發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。