家禽主要組織相容性復(fù)合體結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展

谷洪昌，陳 余，王 梁，呂學(xué)澤，楊衛(wèi)芳，張建偉，曲魯江*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京100193；2.北京市畜牧總站，北京 100101）

主要組織相容性復(fù)合體（Major Histocompatibility Complex，MHC）是由多個(gè)基因組成的基因家族,可以編碼與免疫應(yīng)答相關(guān)的蛋白質(zhì)[1-2]。MHC 具有高度多態(tài)性、連鎖不平衡、單倍型遺傳的特點(diǎn)，在免疫中主要起到抗原呈遞的作用。家禽MHC 的提出最早可追溯到1948 年Briles 研究母雞的溶血性疾病實(shí)驗(yàn)，當(dāng)時(shí)將雞血型系統(tǒng)用字母“D”來表示，1950 年改用字母“B”來表示[3-5]。1961 年，Schierman 等[2]正式將雞的B 復(fù)合體定義為MHC。在家禽中除了有MHC class I 和MHC class II，還具有禽類特有的MHC class IV，它們?cè)陔u上分別被命名為BF、BL 和BG。因?yàn)镸HC class IV 基因只在禽類中出現(xiàn)，所以這類MHC 基因引起較大關(guān)注，被認(rèn)為在家禽抗病免疫方面起著重要的作用[6-7]。20 世紀(jì)90 年代開始，MHC 區(qū)域的基因組研究開始轉(zhuǎn)向其他家禽和野生鳥類，但目前都相對(duì)滯后于在雞上的研究。因此，本研究通過介紹比較雞和其他幾種禽類MHC 結(jié)構(gòu)，了解不同物種MHC 結(jié)構(gòu)研究的歷史和現(xiàn)狀，通過結(jié)構(gòu)差異理解禽類間的遺傳關(guān)系以及抗病性能的差異，有利于抗病育種和禽病免疫的研究。

1 雞（Gallus gallus）MHC 的結(jié)構(gòu)

1977 年P(guān)ink 等[8]定義了雞MHC 的3 個(gè)基因座：B-F、B-L 和B-G。B-F 和B-L 基因座之間物理距離較近但不會(huì)發(fā)生重組，B-G 與B-F、B-L 卻存在著0.05%的重組率[9-11]。這種極低重組率的特性使研究者通常將MHC 作為一個(gè)遺傳單位來進(jìn)行研究，即單倍型遺傳。

1988 年，Guillemot[12]通過克隆測(cè)得了雞MHC 區(qū)域的部分序列，測(cè)得總長(zhǎng)320 kb，包含5 個(gè)BLB 基因和6 個(gè)BF 基因，該研究根據(jù)測(cè)序信息繪制了雞的第一份MHC 基因草圖。1999 年，92 kb 的BF/BL 區(qū)域被測(cè)序，共包含有19 個(gè)基因，其中編碼基因包括2 個(gè)I α 類基因（BFI、BF2） 和2 個(gè)II β 類 基 因（BLB1、BLB2），其 他 分 別 為B30.1、B-BTN1、B30.2、B-BTN2、LeutRNA、Tapasin、RING3、DMA、DMB1、DMB2、TAP1、TAP2、C4（complement 4） 以及CENP-A （histone H3、B-H3）[1]。MHC-I 類基因中，BF2 高度表達(dá)，BF1低度表達(dá)，某些單倍型中BF2 表達(dá)量甚至是BF1 的10倍[13-14]，BF1 位于BMB2 和TAP1 之間，BF2 位于TAP2與C4 基因之間，BF1 與BF2 的轉(zhuǎn)錄方向相反[15]，但均由8 個(gè)外顯子和7 個(gè)內(nèi)含子組成，以上研究結(jié)果表明BF/BL 區(qū)域簡(jiǎn)單緊湊，內(nèi)含子相對(duì)較?。ù蠖鄶?shù)哺乳動(dòng)物MHC 的10%）。與哺乳動(dòng)物MHC 的不同之處在于，雞BF/BL 區(qū)域存在許多對(duì)應(yīng)基因的缺失，以及多出一些哺乳動(dòng)物中未發(fā)現(xiàn)的基因，比如LMP、PSMB8 以及PSMB9 缺失，Blec1、Blec2 和單個(gè)BG 基因的存在[1]。

Shiina 等[16]對(duì)3 個(gè)紅色原雞的BAC 文庫進(jìn)行了克隆，最終得到242 kb 的MHC 序列，包含有46 個(gè)基因。新發(fā)現(xiàn)的MHC 序列延伸了來自于92 kb 的MHC-B 圖譜，在92 kb 中發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)新基因，在其上游和下游各發(fā)現(xiàn)了21 個(gè)和5 個(gè)基因。另外，BG 基因被發(fā)現(xiàn)于延伸區(qū)域的上游，包含有多個(gè)拷貝。Salomonsen 等[7]同樣發(fā)現(xiàn)了在TRIM 基因與Blec 基因的上游存在12 個(gè)BG基因的分布，其中BG2 和BG3 距離這2 個(gè)基因較近，該研究也證明了不同MHC-B 的單倍型，BG 基因的數(shù)目不同，說明雞MHC 存在拷貝數(shù)變異。

1993 年，雞上報(bào)道了另一個(gè)遺傳獨(dú)立的MHC 區(qū)域，并將其命名為Rfp-Y[17]。在這一發(fā)現(xiàn)后不久，2 個(gè)MHC I 類、2 個(gè)MHC II 類基因和1 個(gè)最初分配給MHC-B 的c 型凝集素樣基因被重新分配到MHC-Y[18-19]。Rogers等[20]研究發(fā)現(xiàn)了MHC-Y 的2 個(gè)Ylec 基因，1 個(gè)完整的YF 基因，1 個(gè)截短的YLB 基因以及區(qū)域內(nèi)的CR1 重復(fù)。目前認(rèn)為的遺傳獨(dú)立的基因簇MHC-Y 含有2 個(gè)YF（YFV 和YFVI），3 個(gè)YLB 基 因 (YLBIII、YLBIV 和YLBV)和2 個(gè)Ylec 基因[15]。

雞共有39 對(duì)染色體[21]，其中有30 對(duì)是小染色體，富含基因[22-23]。早在1985 年就確定了雞的MHC 區(qū)域位于第16 號(hào)小染色體（GGA 16）[24]，后人進(jìn)一步確定MHC-B、MHC-Y 作為2 個(gè)獨(dú)立的區(qū)域位于GGA 16 上，并由保守的核仁組織區(qū)（NOR）分開[12,25]。Delany 等[26]通過熒光原位雜交以及胞質(zhì)基因分析法確定了紅色原雞16 號(hào)微染色體的基因結(jié)構(gòu)，糾正了前人所指出的MHC-B 和MHC-Y 分居于NOR 兩側(cè)的結(jié)構(gòu)性錯(cuò)誤，證明了分開2 個(gè)區(qū)域的是一段高GC 含量區(qū)，即PO41重復(fù)[27]。16 號(hào)微染色體總長(zhǎng)約10～15 Mb，基因結(jié)構(gòu)順序從中心粒近端到遠(yuǎn)端依次為NOR、MHC-Y、G+C rich、MHC-B、CD1 基因群，都位于GGA 16 的q 臂上[28]。

2 鵪鶉（Coturnix japonica）MHC 的結(jié)構(gòu)

日本鵪鶉MHC 結(jié)構(gòu)在2004 年由Shiina 等[29]進(jìn)行了比較詳盡的研究，其單倍型1 跨越了180 kb 的基因組區(qū)域，由BG8 延伸至CENP-A，共編碼41 個(gè)基因，相當(dāng)于每4.4 kb 1 個(gè)基因，其基因密度略高于雞BF/BL區(qū)域（92 kb 內(nèi)有19 個(gè)基因）。在這41 個(gè)基因當(dāng)中，有15 個(gè)確定會(huì)表達(dá)的基因，包括6 個(gè)IIB 基因，4 個(gè)I類基因以及TAPBPL、RING3、TAP1、TAP2 和C4；剩余的26 個(gè)基因則根據(jù)其基因結(jié)構(gòu)的完整性被分為“可能表達(dá)的基因”和“假基因”，分別有12 個(gè)和14 個(gè)。除了假基因和RING3 外，其余26 個(gè)基因的編碼產(chǎn)物都會(huì)在免疫過程中發(fā)揮功能。另外，相比于雞BF/BL 區(qū)域存在5 個(gè)CR1，32 個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)，鵪鶉180 kb 區(qū)域內(nèi)包含1 個(gè)CR1，17 個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTRs），2 個(gè)微衛(wèi)星重復(fù)以及37 個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)。

Shiina 的研究通過MHC 序列獨(dú)立證明了不同禽類的進(jìn)化關(guān)系[29]。鵪鶉與雞I 類基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹證明了鵪鶉I 類基因內(nèi)的關(guān)系要比2 個(gè)物種間I 類基因的關(guān)系更加密切，也進(jìn)一步說明鵪鶉MHC I 類基因是在共同祖先分化形成鵪鶉和雞2 個(gè)物種后才形成的。進(jìn)一步地，在對(duì)鵪鶉MHC-II 的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析中得到了同樣的結(jié)果。

3 火雞（Meleagris gallopavo）MHC 的結(jié)構(gòu)

火雞與雞的分化時(shí)間較晚，大約在距今5 000 萬年前兩者分化為獨(dú)立的物種[30]，因此兩者在基因組水平上具有高度的相似性，這種相似性在MHC 結(jié)構(gòu)上更能夠體現(xiàn)出來。

圖1 雞、鵪鶉和火雞MHC-B 區(qū)域的基因結(jié)構(gòu)對(duì)比

Chaves 等[31]得到了197 kb 的火雞B 基因座，該基因座與雞的MHC-B 區(qū)域是同線性的，共包含有34個(gè)基因（從TRIM7.2 到TAP1）。將197 kb 的火雞B基因座同雞170 kb 的B 基因座比對(duì)，同源性達(dá)95%，另外與雞MHC-B 的高GC 含量（55.5%）相似，火雞該區(qū)域的GC 含量也偏高（53.6%）。相比于雞，火雞MHC-B 具有以下特點(diǎn)：①整個(gè)區(qū)域內(nèi)包含12 個(gè)CR1長(zhǎng)末端重復(fù)序列、30 個(gè)簡(jiǎn)單序列重復(fù)序列和3 個(gè)復(fù)雜的重復(fù)，其中出現(xiàn)的大的C/T 五聚體重復(fù)（300 bp）在雞上是沒有的；②多出了3 個(gè)基因，分別是2 個(gè)BG基因和1 個(gè)class II B 基因。Bauer 等[32]擴(kuò)展了火雞的MHC-B，在新擴(kuò)展的40 kb 區(qū)域內(nèi)包括：3 個(gè)BG 基因（BG4、BG5 和一個(gè)不完整的BG6）、KIFC、Blec3、Bzfp3 以及TRIM 的外顯子末端。延伸后的基因座與雞240 kb MHC-B 是線性同源的。

Reed 等[33]證明了火雞也有獨(dú)立的MHC-B 和MHC-Y，且都位于18 號(hào)微染色體上（MGA 18）。目前火雞上已經(jīng)鑒定出2 個(gè)遺傳上獨(dú)立的MHC-Y，且在基因組成上跟雞的MHC-Y 不是直接同源的[33-34]。

4 鴨（Anas platyrhynchos）MHC 的結(jié)構(gòu)

Xia 等[35]通過特定引物克隆出了鴨MHC I 區(qū)域，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，最終得到了2.5 kb 的基因組序列，共編碼344～355 個(gè)氨基酸，包含有7 個(gè)外顯子和8 個(gè)內(nèi)含子。有趣地是，相比于雞的MHC-I，鴨MHC I 類序列更接近于人的MHC I 序列。鴨MHC I 包括有5 個(gè)基因：UAA、UBA、UCA、UDA 和UEA，只有UAA 高表達(dá)，UEA 低表達(dá)，其余則不表達(dá)。這種單個(gè)MHC I類基因的偏向表達(dá)模式只在少數(shù)幾種家禽中才出現(xiàn)，比如雞的BF1 高表達(dá)，BF2 低表達(dá)[1]。Mesa 等[36]證明鴨UAA 基因位于TAP2 一側(cè)，而且MHC I 基因的表達(dá)與TAP 有關(guān)，這種表達(dá)模式能夠促進(jìn)抗體對(duì)MHC I 限制性CTL 抗原簇的識(shí)別，達(dá)到對(duì)病毒的抵御效果[37]。Fleming 等[38]擴(kuò)增了綠頭鴨MHC I 區(qū)域，在38 只鴨中得到了61 個(gè)獨(dú)有的等位基因，證明了MHC I 的等位基因具有高度多態(tài)性。

對(duì)于鴨MHC II 的研究開始相對(duì)較晚。Ren 等[39]通過對(duì)北京鴨BAC 文庫克隆測(cè)序得到了MHC II α 鏈的序列，該序列全長(zhǎng)1 431 bp，編碼255 個(gè)氨基酸，包括4 個(gè)編碼信號(hào)多態(tài)的外顯子和1 個(gè)肽結(jié)合α1區(qū)、免疫球蛋白樣的α2區(qū)域、酸性的連結(jié)肽、疏水的跨膜區(qū)和1 個(gè)較短的胞漿區(qū)尾巴。同樣，該研究的BAC 測(cè)序發(fā)現(xiàn)了緊鄰α 基因的5 個(gè)IIβ 基因（IIb1-IIb5）。與雞、鵪鶉和火雞不同的是，鴨臨近α 基因的β 基因編碼方向相反。同樣，鴨MHC-IIα 基因與人HLA-DRA 的同源性(57.4%)也要高于和雞的同源性(56.7%)。

5 鵝（Anser cygnoides）MHC 的結(jié)構(gòu)

目前，對(duì)于鵝MHC 結(jié)構(gòu)的研究較少，尚處于起步階段。Xia 等[40]克隆 了 鵝 的MHC I（Ancy-MHC I），該cDNA 全長(zhǎng)999 bp，共編碼333 個(gè)氨基酸，其對(duì)應(yīng)的基因組MHC I 區(qū)域全長(zhǎng)為2 489 bp，其中內(nèi)含子長(zhǎng)度為1 490 bp，該內(nèi)含子長(zhǎng)度與鴨極為相似（1 486 bp），但和雞（1 015 bp）差異較大，該區(qū)域鴨與鵝氨基酸同源性（80.0%～85.5%）也要明顯高于雞和鵝的（59.8%～66.0%），以上結(jié)果均證明了鴨與鵝有更近的親緣關(guān)系。

Li 等[41]擴(kuò)增出了Ancy-MHC IIB 的cDNA，共有2 條序列，長(zhǎng)度分別為780 bp 和783 bp，分別編碼成熟蛋白質(zhì)的259、260 個(gè)氨基酸，由6 個(gè)外顯子和5 個(gè)內(nèi)含子組成，內(nèi)含子長(zhǎng)度超過雞，這與MHC I 的研究一致。以上研究的進(jìn)化樹結(jié)果表明，與來自于其他物種已知MHC IIB 類序列相比，鵝、鷸和鴨聚集在了一起，而與雞、哺乳動(dòng)物和魚類分開，這與人們對(duì)進(jìn)化的認(rèn)知基本一致[41]。

6 其他幾種禽類MHC 的結(jié)構(gòu)

Chen 等[42]通過傳統(tǒng)的BAC 克隆得到了3 段朱鹮MHC 序列，分別為265、85、150 kb，其中265 kb 的序列對(duì)應(yīng)BG 區(qū)域，包含有從Blec3 到zfp1 的26 個(gè)基因；85 kb 與150 kb 的區(qū)域?yàn)榇嬖? 個(gè)gap 的核心區(qū)，該區(qū)域包含MHC I、MHC II 類基因和其他基因共28 個(gè)。Chang 等[43]利用二代測(cè)序得到了3 條朱鹮MHC 序列，總共對(duì)應(yīng)488 kb 區(qū)域，包含50 個(gè)基因。Chen 還發(fā)現(xiàn)，相比于雞MHC-B，朱鹮多出COLL11A2 和ADPRH 等基因，另外有更多的Blec 和BF 拷貝。

黑琴雞（Tetrao tetrix）為松雞科琴雞屬鳥類，其MHC-B 全長(zhǎng)88 390 bp，包含19 個(gè)基因，其中有2 個(gè)I 類基因、2 個(gè)II 類基因以及1 個(gè)IV 類基因，與雞的該區(qū)域表現(xiàn)為極高的同線性[44]。

紅腹錦雞（Chrysolophus pictus）是中國(guó)特有的品種，4D BAC 文庫測(cè)序得到了97 kb 的MHC-B 包含20個(gè)基因[45]。紅腹錦雞的MHC IIB 和NK 基因數(shù)量與雞相比差異顯著，另外還有TAPBP 基因和TAP1-TAP2區(qū)域的倒位等差異。

7 小 結(jié)

目前對(duì)于家禽MHC 的研究主要集中在2 個(gè)方面：一是通過不同家禽乃至哺乳動(dòng)物的對(duì)應(yīng)基因的數(shù)據(jù)確定物種之間的進(jìn)化與親緣關(guān)系；二是研究各類MHC 分子及其編碼蛋白在免疫應(yīng)答中的作用。對(duì)MHC 結(jié)構(gòu)的揭示是這兩項(xiàng)研究的基礎(chǔ)與關(guān)鍵。本文詳細(xì)介紹了近幾十年來在幾種家禽上關(guān)于MHC 結(jié)構(gòu)的研究，其中在雞上的相關(guān)研究最為詳盡，確定了MHC 定位于GGA 16，并揭示了整個(gè)微染色體的結(jié)構(gòu)與基因的排列順序。鴨與鵝的研究相對(duì)較少，目前還未能進(jìn)行染色體定位，也無法確定完整的MHC 序列結(jié)構(gòu)。雞MHC I、MHC II 類基因都是雙拷貝的，其中與TAP2 相鄰的MHC II 類基因表現(xiàn)為少見的偏向表達(dá)模式，鴨、鵝、火雞和鵪鶉都具有多個(gè)拷貝的MHC I、MHC II 類基因，只有在鴨中表現(xiàn)為與雞相似的偏向表達(dá)模式。這種單個(gè)拷貝基因的高表達(dá)模式引起了很多研究者的注意，被認(rèn)為是由TAP2 基因引起的，與抗病性有很大關(guān)系。鳥類MHC基因拷貝數(shù)的差異可能是由于它們?cè)谏钪屑?xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外病原體暴露的差異導(dǎo)致的，不同單倍體對(duì)疾病的抗性存在明顯差異[46]。

MHC 結(jié)構(gòu)與家禽的多種傳染病相關(guān)，不同的MHC基因在抗病免疫中所起的作用不同，但目前對(duì)于大多數(shù)家禽MHC 結(jié)構(gòu)的研究還很不完善。一方面，因?yàn)殡p拷貝基因干擾性的存在，以及MHC 區(qū)域高GC 含量、插入缺失過多的特殊性質(zhì)，導(dǎo)致部分序列難以獲得；另一方面，通過構(gòu)建克隆的方法得到的目的基因序列長(zhǎng)度有限，無法得到完整的MHC 序列。隨著未來三代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)、基因組研究水平的提高以及分析手段的豐富，MHC 基因排列順序與結(jié)構(gòu)會(huì)被逐步揭示。