幾種仔豬腸道損傷模型的建立及腸道損傷生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

王 蕾，易 丹，吳 濤，侯永清, *

（1.武漢輕工大學(xué)農(nóng)副產(chǎn)品蛋白質(zhì)飼料資源教育部工程研究中心，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023）

腸道不僅是所有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的最終場(chǎng)所，也是動(dòng)物體內(nèi)最大的免疫器官，是機(jī)體防御體系的第一道屏障，維護(hù)腸道健康對(duì)保障養(yǎng)豬生產(chǎn)至關(guān)重要[1-3]。研究證明，腸道是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的中心器官，各種應(yīng)激因素（如心理性、生理性、營(yíng)養(yǎng)性和病原性的應(yīng)激因子）會(huì)導(dǎo)致腸道結(jié)構(gòu)損傷與功能紊亂，包括腸道屏障功能受損引起局部或系統(tǒng)性的炎性反應(yīng)、腸道分泌與吸收功能異常引起腹瀉等。此外，一些病原性因素（如致病性大腸桿菌、輪狀病毒、傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒等）也會(huì)損傷仔豬腸道的結(jié)構(gòu)與功能。因此，腸道功能紊亂是當(dāng)前危害仔豬健康與生長(zhǎng)的核心問題之一，建立穩(wěn)定可靠的仔豬腸道損傷模型是研究腸道損傷機(jī)制及營(yíng)養(yǎng)干預(yù)的關(guān)鍵。然而，由于實(shí)際條件下腸道損傷的病原（刺激）因子多樣化、致病機(jī)制復(fù)雜、環(huán)境控制要求嚴(yán)格等原因，仔豬腹瀉和腸道損傷動(dòng)物模型通常難以建立[4]。本文主要介紹了本實(shí)驗(yàn)室成功建立的幾種仔豬腸道損傷模型，并總結(jié)了在這些模型下腸道損傷生物標(biāo)志物研究進(jìn)展。

1 單一腸毒素（STa）重組大腸桿菌感染誘導(dǎo)的仔豬腸道損傷模型

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）能引起人和動(dòng)物腸道功能障礙和損傷，并導(dǎo)致斷奶仔豬腹瀉，降低仔豬的生長(zhǎng)性能[4]。ETEC 是引起腹瀉的最常見細(xì)菌病原體，仔豬在感染后常因急性劇烈腹瀉而脫水死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。由于抗生素類藥物的大量添加，近年來具有多重耐藥性的超級(jí)菌株屢見報(bào)道，給ETEC 造成的仔豬腹瀉等疾病的預(yù)防控制和治療帶來巨大挑戰(zhàn)，也對(duì)人類的健康構(gòu)成潛在威脅[5]。

為了克服致病性大腸桿菌的環(huán)境污染及實(shí)驗(yàn)豬普遍具有較強(qiáng)耐受性等問題，本課題組通過基因重組技術(shù)構(gòu)建了表達(dá)單一腸毒素重組大腸桿菌（LMG194-STa），其體外相對(duì)毒性為大腸桿菌K88 的94%[5]，通過LMG194-STa 口腔灌服感染，成功建立了LMG194-STa 誘導(dǎo)下的仔豬腸道損傷模型[4]。

1.1 灌服LMG194-STa 引起仔豬腹瀉 灌服LMG194-STa 前根據(jù)仔豬糞便的稀軟程度判斷腹瀉情況，并記錄仔豬精神狀態(tài)的變化；灌服LMG194-STa 后每隔3～4 h觀察1 次。計(jì)算灌服LMG194-STa 前后的總腹瀉率，腹瀉率= 腹瀉總頭次/（總頭數(shù)× 攻毒天數(shù)）×100%[5]。研究發(fā)現(xiàn)，給7 日齡仔豬灌服2×109CFU LMG194-STa，4 h 后仔豬開始出現(xiàn)精神不濟(jì)，伴隨腹瀉，大部分仔豬呈犬坐姿態(tài)，仔豬腹瀉率增加266.8%[5]。研究表明，大腸桿菌K88 是導(dǎo)致新生或斷奶仔豬腹瀉的重要病原菌之一，主要通過其菌體表面的菌毛黏附素特異性結(jié)合小腸上皮細(xì)胞刷狀緣特定的受體，從而在宿主體內(nèi)定植、大量繁殖、分泌腸毒素導(dǎo)致仔豬腹瀉[6]，而LMG194-STa 則是通過調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的氯離子通道引起的電解質(zhì)失衡，誘發(fā)仔豬腹瀉，兩者都會(huì)導(dǎo)致腸道黏膜的急性損傷[5]。

1.2 灌服LMG194-STa 破壞了仔豬腸道結(jié)構(gòu)形態(tài) 如圖1所示，LMG194-STa 可引起小腸損傷的程度與K88 相同。

圖1 對(duì)照組、LMG194-STa 組和K88 攻毒組空腸光鏡照片（×4） [5]

灌服LMG194-STa 能降低小腸絨毛高度、小腸絨毛高度/ 隱窩深度及絨毛表面積[4]?？梢妴我荒c毒素STa 在一定程度上引發(fā)了小腸絨毛萎縮。這與已發(fā)表的關(guān)于大腸桿菌感染或大腸桿菌等毒素如脂多糖（LPS）對(duì)腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果一致[3,7-8]。小腸絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度、絨毛表面積等指標(biāo)在很大程度上決定了小腸的消化吸收能力。正常生理情況下，小腸的絨毛高度由隱窩細(xì)胞增殖率和細(xì)胞周轉(zhuǎn)率共同決定，絨毛高度、絨毛寬度直接與腸絨毛表面積呈正相關(guān)，與小腸的吸收功能同樣呈正相關(guān)[9]。隱窩是小腸上皮在絨毛根部下陷至固有層而形成的管狀腺，開口于相鄰的絨毛之間。小腸隱窩深度反映了腸上皮細(xì)胞的生成情況，隱窩變淺說明腸上皮細(xì)胞成熟率上升，隱窩的深淺與腸絨毛的正常機(jī)能和完整形態(tài)密切相關(guān)[10]。絨毛高度/隱窩深度綜合反映腸道的功能狀態(tài)，比值降低則說明腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)可能受損[11]，導(dǎo)致腸道吸收功能障礙進(jìn)而引起腹瀉。絨毛表面積則可以直接體現(xiàn)腸絨毛與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收面積，當(dāng)絨毛受損或絨毛萎縮時(shí)，會(huì)降低絨毛表面積，進(jìn)而降低腸道的吸收功能[11]，導(dǎo)致機(jī)體的生長(zhǎng)障礙以及腹瀉等。

1.3 灌服LMG194-STa 對(duì)仔豬血漿D- 木糖和二胺氧化酶（DAO）活性的影響 研究發(fā)現(xiàn)，灌服LMG194-STa 后仔豬血液淋巴細(xì)胞數(shù)量和DAO 水平顯著增加，血漿D-木糖含量顯著降低[4]。DAO 是人類和哺乳動(dòng)物小腸黏膜上層絨毛細(xì)胞中特有的具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，在組胺和多種多胺代謝中起重要作用，能夠直觀反映腸道機(jī)械屏障的完整性和受損傷程度[4]，當(dāng)腸黏膜上皮細(xì)胞受到損傷時(shí)，DAO 才會(huì)被釋放出來進(jìn)入血液，導(dǎo)致血液DAO 活性增高，血漿DAO 活性與腸損傷程度呈正相關(guān)[2,12]。因此，血液中DAO 活性是反映腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性的重要指標(biāo)[7]。血液中D-木糖含量可以體現(xiàn)腸道的通透性，從而評(píng)價(jià)吸收功能的強(qiáng)弱。當(dāng)腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)受損時(shí)，會(huì)導(dǎo)致D-木糖吸收能力下降，血漿D-木糖含量也會(huì)相應(yīng)降低，以上結(jié)果進(jìn)一步說明了灌服LMG194-STa 后仔豬腸道組織形態(tài)受損[4]。

1.4 灌服LMG194-STa 對(duì)仔豬腸道黏膜功能相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響 灌服LMG194-STa 顯著下調(diào)了仔豬空腸中與腸黏膜生長(zhǎng)及完整性有關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量，如腸道絨毛蛋白（villin）、腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（intestinal Fattyacid-Binding Protein，i-FABP）[4]。villin 是絨毛細(xì)胞分化的標(biāo)志物，villin 作為重要的Ca2+肌動(dòng)蛋白，位于小腸黏膜上皮細(xì)胞的刷狀緣，標(biāo)志著腸道細(xì)胞的成熟程度，villin 表達(dá)上調(diào)意味著更多的絨毛細(xì)胞增殖分化[2,13]。villin 基因表達(dá)量的高低被看作是腸道絨毛正常與損傷的標(biāo)志之一[14]。灌服LMG194-STa 可以顯著下調(diào)仔豬空腸和回腸villin 的mRNA 水平[4]，說明灌服LMG194-STa 對(duì)仔豬腸道造成了損傷。i-FABP 是近年來研究較多的用于判定腸道損傷的指標(biāo)[14]。i-FABP主要定位于小腸的腸細(xì)胞，在小腸缺血和細(xì)胞破裂后釋放到血液中。當(dāng)腸絨毛頂端區(qū)域細(xì)胞受損時(shí)，腸黏膜i-FABP 基因表達(dá)量下降和血液i-FABP 含量提高[15-16]。因此，i-FABP 被認(rèn)為是腸道細(xì)胞損傷的另一個(gè)標(biāo)志物。灌服LMG194-STa 后，顯著下調(diào)了仔豬空腸i-FABP 的mRNA 水平[4]，當(dāng)腸絨毛頂端區(qū)域細(xì)胞受損時(shí)，腸黏膜i-FABP 基因表達(dá)量下降[17]?；|(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP3）被認(rèn)為是腸細(xì)胞損傷的標(biāo)志物，在臨床IBD（炎癥性腸病）和腹腔疾病中，MMP3 在腸內(nèi)高表達(dá)[18]。LPS 刺激可以提高仔豬腸道MMP3 mRNA 水平[3]。研究發(fā)現(xiàn)，LMG194-STa 處理后仔豬空腸MMP3 基因表達(dá)水平顯著升高[4]。以上這些結(jié)果表明，LMG194-STa 刺激引起了仔豬腸道損傷。

當(dāng)仔豬受到大腸桿菌感染時(shí)，腸道內(nèi)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)均發(fā)生改變，如IL-1β、IL-4、CCL-2（MCP-1）、CXCL9（MIG）、IFN-γ、HSPH1 和VNN1[4]。本團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，灌服LMG194-STa 顯著上調(diào)了仔豬空腸IL-4、CCL-2、CXCL9 和IFN-γ 的mRNA 水平，但顯著下調(diào)了VNN1 的mRNA 水平[4]。這些結(jié)果表明LMG194-STa 應(yīng)激誘導(dǎo)了仔豬腸道炎癥反應(yīng)。

當(dāng)仔豬受到大腸桿菌的感染時(shí)，可以改變營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)基因（如PCK1、INSR 和LPL）的表達(dá)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，LMG194-STa 刺激下調(diào)了仔豬空腸INSR 和PCK1 及回腸LPL 基因相對(duì)表達(dá)量，但上調(diào)了回腸PCK1 基因相對(duì)表達(dá)量。研究人員推測(cè)，LMG194-STa 可以影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（包括氨基酸、葡萄糖和脂類）在腸道上的代謝[4]。

灌服LMG194-STa 成功建立了單一腸毒素重組大腸桿菌感染誘導(dǎo)的仔豬腸道損傷模型。體外試驗(yàn)研究結(jié)果表明，重組菌株LMG194-STa 與廣譜菌株K88 具有相同的毒性，其毒性高于宿主菌株LMG194[4]。在體內(nèi)試驗(yàn)研究結(jié)果表明，灌服LMG194-STa 可導(dǎo)致仔豬腹瀉，造成腸道黏膜損傷，可以利用該仔豬腹瀉和腸道損傷模型研究不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)腸毒素導(dǎo)致的腸道損傷的保護(hù)作用[4]。

2 豬流行性腹瀉病毒（PEDV）感染誘導(dǎo)的仔豬腸道損傷模型

PEDV 感染引起的仔豬腹瀉是養(yǎng)豬生產(chǎn)中常見疾病之一。目前國(guó)內(nèi)外動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究中關(guān)于PEDV 感染仔豬模型的研究鮮有報(bào)道。PEDV 屬于尼多病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬，其基因組是單股正鏈具有感染性的RNA，5′端有1 個(gè)帽子結(jié)構(gòu)（cap），3′端有1 個(gè)Poly（A）。PEDV 主要的結(jié)構(gòu)蛋白包括纖突蛋白（Spike protein，S）、膜蛋白（Membrane protein，M）和核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，N）。灌服PEDV 后仔豬腸道可定植大量的PEDV[14]。PEDV 感染會(huì)引起急性、重度萎縮性腸炎，并伴有病毒血癥[19]。本課題組經(jīng)過多次試驗(yàn)，探索出了一種豬腸道損傷的PEDV 感染模型：給14 日齡仔豬單次灌服104.5TCID50的PEDV YN 株。通過設(shè)計(jì)合成PEDV 膜蛋白（M 蛋白）和核衣殼蛋白（N 蛋白）基因的引物，利用qRT-PCR 方法檢測(cè)到仔豬空腸黏膜PEDV M 和N 蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量顯著增加，抗病毒蛋白MX1 在空腸和回腸中的基因相對(duì)表達(dá)量也顯著提高，表明PEDV 攻毒成功[2,14]。MX 蛋白（黏病毒抗性蛋白）是細(xì)胞抗病毒的重要先天性介質(zhì)[20]。MX1 是I 型干擾素的重要下游效應(yīng)物[21]，MX1 基因已被證明具有抗多種RNA 病毒的抗病功能，包括豬的甲型流感病毒[20]。此外，MX1 在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用[21]，病毒感染可以誘導(dǎo)其表達(dá)[22-23]。

2.1 PEDV 感染對(duì)仔豬腹瀉率及血液生化指標(biāo)的影響 研究發(fā)現(xiàn)，PEDV 感染仔豬均出現(xiàn)腹瀉、犬坐、食欲不振、嘔吐的表觀癥狀，該試驗(yàn)劑量下（單次灌服104.5TCID50），PEDV 感染顯著提高了仔豬腹瀉率（100%），但并未引起仔豬的死亡[2,14]。PEDV 感染后，仔豬平均日增重顯著降低了37.4%[14]。另外，PEDV 感染提高了仔豬血漿總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、甲狀腺球蛋白（TG）、尿素氮（BUN）、血氯（CL）等含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）活性，表明PEDV 感染容易導(dǎo)致仔豬代謝改變[2]。

2.2 PEDV 感染對(duì)仔豬氧化應(yīng)激的影響 活性氧（ROS）的產(chǎn)生及升高被認(rèn)為是包括消化性潰瘍、炎癥性腸?。↖BD）和胃腸道癌癥等胃腸道黏膜疾病發(fā)病的一個(gè)重要因素[2,24]。丙二醛（MDA）是氧化損傷的重要指標(biāo)，可作為體內(nèi)氧化應(yīng)激的標(biāo)志[1-2,25]。ROS（如H2O2）主要由線粒體作為正常代謝的副產(chǎn)物產(chǎn)生[26]。細(xì)胞具有防御ROS 和其他氧化劑的防御機(jī)制，抗氧化酶包括過氧化氫酶（CAT）催化H2O2還原為水[27]。PEDV 感染顯著降低了血漿和回腸CAT 活性，但顯著提高了血漿和小腸MDA 和H2O2含量[2]，說明口腔灌服PEDV 可以引起機(jī)體與腸道氧化應(yīng)激[2]。

2.3 PEDV 感染對(duì)仔豬腸黏膜生長(zhǎng)和形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響腸道黏膜中總蛋白、RNA 和DNA 含量、RNA/DNA可以用來評(píng)估腸道生長(zhǎng)和發(fā)育[2,28]。研究表明，PEDV感染顯著降低了空腸和回腸RNA 含量和回腸RNA/DNA[2]，說明PEDV 感染影響了仔豬腸黏膜的生長(zhǎng)。

完整的腸道屏障在防止腸腔病原微生物和飲食過敏原滲入腸道黏膜中起重要作用[2]。研究表明，PEDV 感染顯著降低了仔豬血漿D- 木糖含量[2,14]，同時(shí)顯著提高了血漿中DAO 活性[2]。此外，PEDV 感染導(dǎo)致小腸中的i-FABP 表達(dá)顯著降低[2,14]。這些結(jié)果表明，PEDV感染可以誘導(dǎo)腸道黏膜損傷，影響小腸的吸收和完整性。

進(jìn)一步研究PEDV 感染對(duì)7 日齡仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響發(fā)現(xiàn)，PEDV 感染顯著降低了仔豬小腸絨毛高度，提高了小腸隱窩深度，降低了小腸絨毛高度/隱窩深度[2,14]，顯著降低了空腸和回腸絨毛表面積[2]。與灌服LMG194-STa 有類似結(jié)果，PEDV 感染仔豬下調(diào)了小腸villin 的mRNA 水平，說明PEDV 誘導(dǎo)了小腸細(xì)胞死亡[2]。以上結(jié)果說明，PEDV 感染損害了仔豬腸道生長(zhǎng)與形態(tài)結(jié)構(gòu)。

綜上所述，PEDV 感染可降低仔豬的生長(zhǎng)性能，引起仔豬嚴(yán)重腹瀉、腸道絨毛萎縮、吸收與屏障功能紊亂，并不導(dǎo)致仔豬死亡。該模型的建立將為PEDV 感染仔豬腸道功能的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控研究提供有效技術(shù)手段。

3 直腸灌注乙酸誘導(dǎo)的仔豬結(jié)腸炎模型

潰瘍性結(jié)腸炎模型動(dòng)物以鼠類為主，鮮有仔豬的潰瘍性結(jié)腸炎模型。本研究團(tuán)隊(duì)在仔豬上建立了一種簡(jiǎn)便易行、重復(fù)性好、穩(wěn)定的潰瘍性結(jié)腸炎模型[1,25]。通過直腸灌注乙酸（10 mL，10%v/v，由肛門導(dǎo)管導(dǎo)入25 cm處，灌注1 次）誘導(dǎo)仔豬潰瘍性結(jié)腸炎的模型，仔豬結(jié)腸上皮脫落，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（如圖2）。乙酸誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎模型是一種典型的化學(xué)誘導(dǎo)性炎癥模型，采用乙酸化學(xué)性刺激劑可以造成腸黏膜化學(xué)性損傷，繼而產(chǎn)生炎性癥狀[29]。利用該模型課題組研究了功能性氨基酸[25]和三丁酸甘油酯[1]對(duì)仔豬結(jié)腸功能的保護(hù)作用。

直腸灌注10%乙酸后，仔豬倦怠懶動(dòng)、后背微弓（推測(cè)有腹痛感），采食下降，出現(xiàn)稀便與膿血便，血便中可見腸黏膜脫落，血便第2 天消失，但仍有稀便，第3天恢復(fù)正常[29]。

圖2 直腸灌注乙酸后結(jié)腸的形態(tài)學(xué)變化[1]

在乙酸刺激誘導(dǎo)的仔豬潰瘍性結(jié)腸炎模型中，結(jié)腸黏膜損傷肉眼觀察評(píng)分和病理切片組織學(xué)評(píng)分均顯著高于對(duì)照組[25,29]，表現(xiàn)為潰瘍和炎性細(xì)胞明顯浸潤(rùn)，組織學(xué)潰瘍表現(xiàn)為結(jié)腸黏膜壞死、發(fā)炎，中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主要浸潤(rùn)細(xì)胞（圖2）。乙酸刺激仔豬顯著降低了回腸絨毛高度/隱窩深度及結(jié)腸杯狀細(xì)胞比例，顯著提高了上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞密度[1,25]。

仔豬直腸灌注10%乙酸后3 d，腸外壁嚴(yán)重粘連和水腫，均出現(xiàn)潰瘍，病理切片可見結(jié)腸黏膜炎性細(xì)胞重度浸潤(rùn)，重度纖維化，黏膜下層大量增厚，黏膜上皮壞死溶解脫落，有大量淋巴細(xì)胞、多形核細(xì)胞、漿細(xì)胞，毛細(xì)血管充血，腸腺間質(zhì)出血。灌注后7 d 可見潰瘍?cè)蠲撀洌杂忻?xì)血管充血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但對(duì)比灌腸后3 d 已明顯減少，另有大量成纖維細(xì)胞增生[29]。

以上這些結(jié)果表明直腸灌注10%乙酸成功誘導(dǎo)了仔豬結(jié)腸炎。

4 吲哚美辛（IDMT）誘導(dǎo)的仔豬腸道損傷模型

IDMT 是一種非甾體抗炎藥（NSAID），它通過抑制前列腺素合成而引起大鼠小腸的嚴(yán)重炎癥和潰瘍[30]。IDMT 在豬上誘導(dǎo)的腸道損傷鮮見報(bào)道。本團(tuán)隊(duì)通過多次摸索，采用IDMT 作為炎性損傷誘導(dǎo)劑，建立了仔豬腸道損傷模型：選用7 日齡杜×長(zhǎng)×大仔豬（2.96±0.24） kg，飼喂7 d 后開始腹腔注射IDMT（5 mg/kg 體重）；連續(xù)注射3 d，然后采集血液和腸道樣品測(cè)定與腸道損傷相關(guān)的指標(biāo)。結(jié)果顯示（圖3）IDMT 顯著提高了血漿DAO 活性、i-FABP 含量、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量、腸道MMP3 mRNA 水平、髓過氧化酶（MPO）活性和MDA濃度，但顯著降低了血漿瓜氨酸濃度、腸道谷胱甘肽過氧物酶（GSH-Px）活性、villin、i-FABP、瞬時(shí)受體陽離子通道亞家族V 成員6（TRPV6）、水通道蛋白質(zhì)（AQP10）和內(nèi)向整流鉀離子通道13（KCNJ13）的mRNA 水平[30]。此外，在IDMT 刺激仔豬的空腸遠(yuǎn)端和回腸有大量出血點(diǎn)、腸壁變薄和潰瘍，IDMT 顯著降低仔豬小腸絨毛高度和絨毛表面積[30]。以上結(jié)果表明，IDMT 提高了小腸中的促炎基因表達(dá)和血液中嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的水平，導(dǎo)致仔豬腸道炎性損傷和氧化應(yīng)激，并阻礙了腸黏膜生長(zhǎng)和腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸[30]。IDMT 誘導(dǎo)的仔豬腸道損傷模型可進(jìn)行人和動(dòng)物腸道功能障礙及營(yíng)養(yǎng)干預(yù)的研究。

圖3 IDMT 對(duì)仔豬腸道損傷作用[30]

4.1 IDMT 對(duì)仔豬血液學(xué)指標(biāo)的影響 在IDMT 誘導(dǎo)的仔豬腸道損傷模型中，IDMT 顯著提高了血漿DAO 活性、i-FABP 含量、NEUT 和EOS，但降低了血漿中淋巴數(shù)量和瓜氨酸濃度[30]。研究表明，IDMT 容易引起細(xì)菌易位，從而導(dǎo)致嚴(yán)重急性炎癥和腸屏障功能紊亂[31]。因此，IDMT 誘導(dǎo)的血液免疫細(xì)胞數(shù)量的增加可能是由腸道炎癥和細(xì)菌易位引起[30]。

血漿DAO、血漿和小腸中的i-FABP 是腸道損傷的生物標(biāo)志物。在本腸道損傷模型中，IDMT 提高了仔豬血漿DAO 活性和i-FABP 水平[30]，但降低了仔豬空腸和回腸中的i-FABP mRNA 水平[30]，表明IDMT 可以引起仔豬腸道損傷。這與IDMT 降低了血液中瓜氨酸水平的結(jié)果一致，血漿瓜氨酸降低也被認(rèn)為是腸道損傷的有效生物標(biāo)志物[32]。

4.2 IDMT 對(duì)仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 IDMT 刺激后，仔豬的空腸遠(yuǎn)端和回腸有大量出血點(diǎn)、腸壁變薄和潰瘍；IDMT 顯著降低仔豬小腸絨毛高度和絨毛表面積，表明IDMT 造成了仔豬腸道損傷[30]。

IDMT 可引起嚴(yán)重的腸道炎癥和潰瘍。IDMT 降低腸內(nèi)源性前列腺素的產(chǎn)生，導(dǎo)致微循環(huán)障礙、腸粘液減少、細(xì)胞間連接的破壞及黏膜通透性增加[30-31]。黏膜損傷可歸因于膽汁酸、蛋白水解酶、腸桿菌和毒素的滲透以及炎癥細(xì)胞因子的分泌、嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[31]。

4.3 IDMT 誘導(dǎo)仔豬氧化應(yīng)激 IDMT 刺激提高了仔豬血漿H2O2水平、空腸MDA 濃度和MPO 活性，降低了空腸GSH-Px 活性。作為一種非甾體抗炎藥，IDMT 能溶解腸細(xì)胞膜磷脂，損傷上皮細(xì)胞線粒體，導(dǎo)致細(xì)胞間鈣外排和自由基產(chǎn)生，從而導(dǎo)致腸道過氧化和黏膜氧化應(yīng)激。研究表明，口服IDMT 引起小腸潰瘍，這可能與小腸中MPO 活性的顯著增加相關(guān)[30]。

4.4 IDMT 對(duì)腸黏膜基因表達(dá)的影響 在本腸道損傷模型中，IDMT 刺激可下調(diào)回腸villin、i-FABP、TRPV6、AQP10 和KCNJ13 的mRNA 水平，但上調(diào)了仔豬空腸和 回 腸 中MMP3、pBD-1 和IL-8 的mRNA 水 平[30]。如前所述，血漿i-FABP 水平升高和腸道i-FABP 下調(diào)也表明IDMT 引起腸損傷。此外，MMP3 是腸道損傷的重要介質(zhì)，包括免疫介導(dǎo)的腸損傷[18]，IDMT 誘導(dǎo)MMP3 mRNA 水平升高進(jìn)一步證實(shí)了IDMT 引起了腸損傷。此外，在本模型中，IDMT 刺激引起的腸道炎癥，上調(diào)了空腸和回腸中IL-8 和pBD-1 mRNA 水平。

在IDMT 誘導(dǎo)的仔豬腸道損傷的模型中還發(fā)現(xiàn)，IDMT 刺激可以下調(diào)腸營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)，如TRPV6、KCNJ13 和AQP10。TRPV6 是近年來發(fā)現(xiàn)的一種高選擇性的Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)通道，主要負(fù)責(zé)Ca2+由細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)的主動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，在機(jī)體內(nèi)參與多種病理生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)[33]，參與腸道跨細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)[34]。而AQP10 是水通道蛋白質(zhì)，在腸黏膜上皮細(xì)胞中表達(dá)[35]。同樣，以往研究表明，LPS 刺激下調(diào)了仔豬空腸AQP 3和AQP10 的基因相對(duì)表達(dá)量[3]。

因此，IDMT 不僅引起腸道損傷，而且降低了腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸能力[30]。

5 腸道損傷相關(guān)標(biāo)志物的研究

通過應(yīng)用以上這些仔豬腸道損傷模型，本團(tuán)隊(duì)研究了腸道損傷的標(biāo)志物。血中DAO 活性與仔豬腹瀉程度顯著相關(guān)，可以用DAO 活力檢測(cè)和D-木糖試驗(yàn)來評(píng)價(jià)腸道功能。仔豬腸道損傷與血漿DAO 活性和i-FABP 水平密切相關(guān)。當(dāng)仔豬腸道受損，腹瀉率增加，血漿DAO活性和i-FABP 水平顯著提高。給仔豬灌服D-木糖，若腸道功能受損，則D-木糖吸收能力降低，血液D-木糖水平顯著降低。因此，仔豬血漿D-木糖水平能較好地反映腸黏膜的完整性與吸收功能。此外，在這幾種仔豬腸道損傷試驗(yàn)?zāi)Ｐ拖?，腸黏膜villin、i-FABP、pBD-1、KCNJ13 的基因相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，而MMP3 基因相對(duì)表達(dá)量均增加。因此，以血漿DAO 活性、瓜氨酸 和i-FABP 水平，腸 黏 膜Villin、iFABP、MMP3、pBD-1、KCNJ13 基因?yàn)闃?biāo)志物，結(jié)合D- 木糖吸收試驗(yàn)和腸黏膜形態(tài)學(xué)觀測(cè)的腸道功能檢測(cè)方法與體系，可為診斷仔豬腸道疾病提供理論依據(jù)。

6 小 結(jié)

本實(shí)驗(yàn)室成功建立了幾種仔豬腸道損傷模型：①灌服LMG194-STa 誘導(dǎo)的仔豬腸道損傷模型；②灌服PEDV 誘導(dǎo)的仔豬腸道損傷模型；③直腸灌注乙酸誘導(dǎo)的仔豬潰瘍性結(jié)腸炎模型；④腹腔多次注射IDMT 誘導(dǎo)的仔豬腸道炎性損傷模型。這幾種腸道損傷模型為豬和人類的腸道功能障礙研究和營(yíng)養(yǎng)干預(yù)提供了技術(shù)手段，同時(shí)，應(yīng)用這些模型本團(tuán)隊(duì)確定了腸道損傷的系列標(biāo)志物，可為仔豬腸道疾病的診斷提供重要依據(jù)。